Ферменты изоферменты. Изоферменты

Изоферменты. Часть ферментов состоят не из одной белковой цепочки, а из нескольких субъединиц. Изоферменты – это семейство ферментов, которые катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по строению и физико-химическим свойствам.

Например: лактатдегидрогеназа (ЛДГ) состоит их 4 субъединиц 2хтипов: субъединица Н, выделенная из сер дечной мышцы (heart – сердце), субъединица М, выделенная из скелетных мышц (musculus – мышца). Эти субъединицы кодируются разными генами. В разных органах имеются различные формы ЛДГ с различным набором субъединиц. Известно 5 изоферментов ЛДГ:
ЛДГ1: ЛДГ2: ЛДГ3: ЛДГ4: ЛДГ5: (Н4) (Н3М) (Н2М2) (НМ3) (М4)
ЛДГ1 экспрессируется в сердечной мышце и мозге, а ЛДГ5 – в скелетных мышцах и печени. Остальные формы в других органах. Появление ЛДГ в крови свидетельствует о повреждении органов (фермент из разрушенных клеток поступает в кровь – гиперферментемия) Повышение активности фракции ЛДГ1 в крови наблюдается при повреждении сердечной мышцы (инфаркт миокарда), а повышение активности ЛДГ5 в крови наблюдается при гепатитах и повреждении скелетных мышц. То есть благодаря изоферментам можно определить локализацию поврежденного органа. Наиболее чувствительным тестом на инфаркт миокарда является повышение в крови сердечного изофермента креатинкиназы.

Энзимопатии наследственные (фенилкетонурия) и приобретенные (цинга). Применение ферментов для лечения болезней.

В основе многих заболеваний лежат нарушения функционирования ферментов в клетке - энзимопатии. Различают первичные (наследственные) и вторичные (приобретённые) энзимопатии. Приобретённые энзимопатии, как и вообще протеинопатии, по-видимому, наблюдают при всех болезнях.

При первичных энзимопатиях дефектные ферменты наследуются, в основном, по аутосомнорецессивному типу. Гетерозиготы, чаще всего, не имеют фенотипических отклонений. Первичные энзимопатии обычно относят к метаболическим болезням, так как происходит нарушение определённых метаболических путей. При этом развитие заболевания может протекать по одному из ниже перечисленных "сценариев". Рассмотрим условную схему метаболического пути:

Вещество А в результате последовательных ферментативных реакций превращается в продукт Р. При наследственной недостаточности какого-либо фермента, например фермента Е3, возможны разные нарушения метаболических путей:

Нарушение образования конечных продуктов. Недостаток конечного продукта этого метаболического пути (Р) (при отсутствии альтернативных путей синтеза) может приводить к развитию клинических симптомов, характерных для данного заболевания:

Накопление субстратов-предшественников. При недостаточности фермента Е 3 будут накапливаться вещество С, а также во многих случаях и предшествующие соединения. Увеличение субстратов-предшественников дефектного фермента - ведущее звено развития многих заболеваний:

Нарушение образования конечных продуктов и накопление субстратов предшественников. Отмечают заболевания, когда одновременно недостаток продукта и накопление исходного субстрата вызывают клинические проявления.

Ферментные препараты широко используют в медицине. Ферменты в медицинской практике находят применение в качестве диагностических (энзимодиагностика) и терапевтических (энзимотерапия) средств. Кроме того, ферменты используют в качестве специфических реактивов для определения ряда веществ. Так, глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови. Фермент уреазу используют для определения содержания количества мочевины в крови и моче. С помощью различных дегидрогеназ обнаруживают соответствующие субстраты, например пируват, лактат, этиловый спирт и др.

А. Энзимодиагностика

Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:

• при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;
• количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;
• активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени И отличается от нормальных значений;
• ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);
• существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.

В клетке любого живого организма протекают миллионы химических реакций. Каждая из них имеет большое значение, поэтому важно поддерживать скорость биологических процессов на высоком уровне. Почти каждая реакция катализируется своим ферментом. Что такое ферменты? Какова их роль в клетке?

Ферменты. Определение

Термин "фермент" происходит от латинского fermentum - закваска. Также они могут называться энзимами от греческого en zyme - "в дрожжах".

Ферменты - биологически активные вещества, поэтому любая реакция, протекающая в клетке, не обходится без их участия. Эти вещества выполняют роль катализаторов. Соответственно, любой фермент обладает двумя основными свойствами:

1) Энзим ускоряет биохимическую реакцию, но при этом не расходуется.

2) Величина константы равновесия не меняется, а лишь ускоряется достижение этого значения.

Ферменты ускоряют биохимические реакции в тысячу, а в некоторых случаях в миллион раз. Это значит, что при отсутствии ферментативного аппарата все внутриклеточные процессы практически остановятся, а сама клетка погибнет. Поэтому роль ферментов как биологически активных веществ велика.

Разнообразие энзимов позволяет разносторонне регулировать метаболизм клетки. В любом каскаде реакций принимает участие множество ферментов различных классов. Биологические катализаторы обладают большой избирательностью благодаря определенной конформации молекулы. Т. к. энзимы в большинстве случаев имеют белковую природу, они находятся в третичной или четвертичной структуре. Объясняется это опять же специфичностью молекулы.

Функции энзимов в клетке

Главная задача фермента - ускорение соответствующей реакции. Любой каскад процессов, начиная с разложения пероксида водорода и заканчивая гликолизом, требует присутствия биологического катализатора.

Правильная работа ферментов достигается высокой специфичностью к определенному субстрату. Это значит, что катализатор может ускорять только определенную реакцию и никакую больше, даже очень похожую. По степени специфичности выделяют следующие группы энзимов:

1) Ферменты с абсолютной специфичностью, когда катализируется только одна-единственная реакция. Например, коллагеназа расщепляет коллаген, а мальтаза расщепляет мальтозу.

2) Ферменты с относительной специфичностью. Сюда входят такие вещества, которые могут катализировать определенный класс реакций, к примеру, гидролитическое расщепление.

Работа биокатализатора начинается с момента присоединения его активного центра к субстрату. При этом говорят о комплементарном взаимодействии наподобие замка и ключа. Здесь имеется в виду полное совпадение формы активного центра с субстратом, что дает возможность ускорять реакцию.

Следующий этап заключается в протекании самой реакции. Ее скорость возрастает благодаря действию ферментативного комплекса. В конечном итоге мы получаем энзим, который связан с продуктами реакции.

Заключительный этап - отсоединение продуктов реакции от фермента, после чего активный центр вновь становится свободным для очередной работы.

Схематично работу фермента на каждом этапе можно записать так:

1) S + E ——> SE

2) SE ——> SP

3) SP ——> S + P , где S - это субстрат, E - фермент, а P - продукт.

Классификация ферментов

В организме человека можно найти огромное количество ферментов. Все знания об их функциях и работе были систематизированы, и в итоге появилась единая классификация, благодаря которой можно легко определить, для чего предназначен тот или иной катализатор. Здесь представлены 6 основных классов энзимов, а также примеры некоторых подгрупп.

1. Оксидоредуктазы.

Ферменты этого класса катализируют окислительно-восстановительные реакции. Всего выделяют 17 подгрупп. Оксидоредуктазы обычно имеют небелковую часть, представленную витамином или гемом.

Среди оксидоредуктаз часто встречаются следующие подгруппы:

а) Дегидрогеназы. Биохимия ферментов-дегидрогеназ заключается в отщеплении атомов водорода и переносе их на другой субстрат. Эта подгруппа чаще всего встречается в реакциях дыхания, фотосинтеза. В составе дегидрогеназ обязательно присутствует кофермент в виде НАД/НАДФ или флавопротеидов ФАД/ФМН. Нередко встречаются ионы металлов. Примерами могут служить такие энзимы, как цитохромредуктазы, пируватдегидрогеназа, изоцитратдегидрогеназа, а также многие ферменты печени (лактатдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа и т. д.).

б) Оксидазы. Ряд ферментов катализирует присоединение кислорода к водороду, в результате чего продуктами реакции могут быть вода или пероксид водорода (H 2 0, H 2 0 2). Примеры ферментов: цитохромоксидаза, тирозиназа.

в) Пероксидазы и каталазы - энзимы, катализирующие распад H 2 O 2 на кислород и воду.

г) Оксигеназы. Эти биокатализаторы ускоряют присоединение кислорода к субстрату. Дофамингидроксилаза - один из примеров таких энзимов.

2. Трансферазы.

Задача ферментов этой группы состоит в переносе радикалов от вещества-донора к веществу-реципиенту.

а) Метилтрансферазы. ДНК-метилтрансферазы - основные ферменты, контролирующие процесс репликации нуклеотидов играет большую роль в регуляции работы нуклеиновой кислоты.

б) Ацилтрансферазы. Энзимы этой подгруппы транспортируют ацильную группу с одной молекулы на другую. Примеры ацилтрансфераз: лецитинхолестеринацилтрансфераза (переносит функциональную группу с жирной кислоты на холестерин), лизофосфатидилхолинацилтрансфераза (ацильная группа переносится на лизофосфатидилхолин).

в) Аминотрансферазы - ферменты, которые участвуют в превращении аминокислот. Примеры ферментов: аланинаминотрансфераза, которая катализирует синтез аланина из пирувата и глутамата путем переноса аминогруппы.

г) Фосфотрансферазы. Ферменты этой подгруппы катализируют присоединение фосфатной группы. Другое название фосфотрансфераз, киназы, встречается намного чаще. Примерами могут служить такие энзимы, как гексокиназы и аспартаткиназы, которые присоединяют фосфорные остатки к гексозам (чаще всего к глюкозе) и к аспарагиновой кислоте соответственно.

3. Гидролазы - класс энзимов, которые катализируют расщепление связей в молекуле с последующим присоединением воды. Вещества, которые относятся к этой группе, - основные ферменты пищеварения.

а) Эстеразы - разрывают эфирные связи. Пример - липазы, которые расщепляют жиры.

б) Гликозидазы. Биохимия ферментов этого ряда заключается в разрушении гликозидных связей полимеров (полисахаридов и олигосахаридов). Примеры: амилаза, сахараза, мальтаза.

в) Пептидазы - энзимы, катализирующие разрушение белков до аминокислот. К пептидазам относятся такие ферменты, как пепсины, трипсин, химотрипсин, карбоиксипептидаза.

г) Амидазы - расщепляют амидные связи. Примеры: аргиназа, уреаза, глутаминаза и т. д. Многие ферменты-амидазы встречаются в

4. Лиазы - ферменты, по функции схожие с гидролазами, однако при расщеплении связей в молекулах не затрачивается вода. Энзимы этого класса всегда имеют в составе небелковую часть, например, в виде витаминов В1 или В6.

а) Декарбоксилазы. Эти ферменты действуют на С-С связь. Примерами могут служить глутаматдекарбоксилаза или пируватдекарбоксилаза.

б) Гидратазы и дегидратазы - ферменты, которые катализируют реакцию расщепления связей С-О.

в) Амидин-лиазы - разрушают С-N связи. Пример: аргининсукцинатлиаза.

г) Р-О лиазы. Такие ферменты, как правило, отщепляют фосфатную группу от вещества-субстрата. Пример: аденилатциклаза.

Биохимия ферментов основана на их строении

Способности каждого энзима определяются индивидуальным, только ему свойственным строением. Любой фермент - это, прежде всего, белок, и его структура и степень сворачивания играют решающую роль в определении его функции.

Для каждого биокатализатора характерно наличие активного центра, который, в свою очередь, делится на несколько самостоятельных функциональных областей:

1) Каталитический центр - это специальная область белка, по которой происходит присоединение фермента к субстрату. В зависимости от конформации белковой молекулы каталитический центр может принимать разнообразную форму, которая должна соответствовать субстрату так же, как замок ключу. Такая сложная структура объясняет то, что находится в третичном или четвертичном состоянии.

2) Адсорбционный центр - выполняет роль «держателя». Здесь в первую очередь происходит связь между молекулой фермента и молекулой-субстратом. Однако связи, которые образует адсорбционный центр, очень слабые, а значит, каталитическая реакция на этом этапе обратима.

3) Аллостерические центры могут располагаться как в активном центре, так и по всей поверхности фермента в целом. Их функция - регулирование работы энзима. Регулирование происходит с помощью молекул-ингибиторов и молекул-активаторов.

Активаторные белки, связываясь с молекулой фермента, ускоряют его работу. Ингибиторы же, напротив, затормаживают каталитическую активность, причем это может происходить двумя способами: либо молекула связывается с аллостерическим центром в области активного центра фермента (конкурентное ингибирование), либо она присоединяется к другой области белка (неконкурентное ингибирование). считается более действенным. Ведь при этом закрывается место для связывания субстрата с ферментом, причем этот процесс возможен только в случае практически полного совпадения формы молекулы ингибитора и активного центра.

Энзим зачастую состоит не только из аминокислот, но и из других органических и неорганических веществ. Соответственно, выделяют апофермент - белковую часть, кофермент - органическую часть, и кофактор - неорганическую часть. Кофермент может быть представлен улгеводами, жирами, нуклеиновыми кислотами, витаминами. В свою очередь, кофактор - это чаще всего вспомогательные ионы металлов. Активность ферментов определяется его строением: дополнительные вещества, входящие в состав, меняют каталитические свойства. Разнообразные виды ферментов - это результат комбинирования всех перечисленных факторов образования комплекса.

Регуляция работы ферментов

Энзимы как биологически активные вещества не всегда необходимы организму. Биохимия ферментов такова, что они могут в случае чрезмерного катализа навредить живой клетке. Для предотвращения пагубного влияния энзимов на организм необходимо каким-то образом регулировать их работу.

Т. к. ферменты имеют белковую природу, они легко разрушаются при высоких температурах. Процесс денатурации обратим, однако он может существенно повлиять на работу веществ.

pH также играет большую роль в регуляции. Наибольшая активность ферментов, как правило, наблюдается при нейтральных значениях pH (7,0-7,2). Также есть энзимы, которые работают только в кислой среде или только в щелочной. Так, в клеточных лизосомах поддерживается низкий pH, при котором активность гидролитических ферментов максимальна. В случае их случайного попадания в цитоплазму, где среда уже ближе к нейтральной, их активность снизится. Такая защита от «самопоедания» основана на особенностях работы гидролаз.

Стоит упомянуть о значении кофермента и кофактора в составе ферментов. Наличие витаминов или ионов металла существенно влияет на функционирование некоторых специфических энзимов.

Номенклатура ферментов

Все ферменты организма принято называть в зависимости от их принадлежности к какому-либо из классов, а также по субстрату, с которым они вступают в реакцию. Иногда по используют в названии не один, а два субстрата.

Примеры названия некоторых энзимов:

1. Ферменты печени: лактат-дегидроген-аза, глутамат-дегидроген-аза.
2. Полное систематическое название фермента: лактат-НАД+-оксидоредукт-аза.

Сохранились и тривиальные названия, которые не придерживаются правил номенклатуры. Примерами являются пищеварительные ферменты: трипсин, химотрипсин, пепсин.

Процесс синтеза ферментов

Функции ферментов определяются еще на генетическом уровне. Т. к. молекула по большому счету - белок, то и ее синтез в точности повторяет процессы транскрипции и трансляции.

Синтез ферментов происходит по следующей схеме. Вначале с ДНК считывается информация о нужном энзиме, в результате чего образуется мРНК. Матричная РНК кодирует все аминокислоты, которые входят в состав энзима. Регуляция ферментов может происходить и на уровне ДНК: если продукта катализируемой реакции достаточно, транскрипция гена прекращается и наоборот, если возникла потребность в продукте, активизируется процесс транскрипции.

После того как мРНК вышла в цитоплазму клетки, начинается следующий этап - трансляция. На рибосомах эндоплазматической сети синтезируется первичная цепочка, состоящая из аминокислот, соединенных пептидными связями. Однако молекула белка в первичной структуре еще не может выполнять свои ферментативные функции.

Активность ферментов зависит от структуры белка. На той же ЭПС происходит скручивание протеина, в результате чего образуются сначала вторичная, а потом третичная структуры. Синтез некоторых ферментов останавливается уже на этом этапе, однако для активизации каталитической активности зачастую необходимо присоединение кофермента и кофактора.

В определенных областях эндоплазматической сети происходит присоединение органических составляющих энзима: моносахаридов, нуклеиновых кислот, жиров, витаминов. Некоторые ферменты не могут работать без наличия кофермента.

Кофактор играет решающую роль в образовании Некоторые функции ферментов доступны только при достижении белком доменной организации. Поэтому для них очень важно наличие четвертичной структуры, в которой соединяющим звеном между несколькими глобулами белка является ион металла.

Множественные формы ферментов

Встречаются ситуации, когда необходимо наличие нескольких энзимов, катализирующих одну и ту же реакцию, но отличающихся друг от друга по каким-либо параметрам. Например, фермент может работать при 20 градусах, однако при 0 градусов он уже не сможет выполнять свои функции. Что делать в подобной ситуации живому организму при низких температурах среды?

Эта проблема легко решается наличием сразу нескольких ферментов, катализирующих одну и ту же реакцию, но работающих в разных условиях. Существуют два типа множественных форм энзимов:

1. Изоферменты. Такие белки кодируются разными генами, состоят из разных аминокислот, однако катализируют одну и ту же реакцию.
2. Истинные множественные формы. Эти белки транскрибируются с одного и того же гена, однако на рибосомах происходит модификация пептидов. На выходе получают несколько форм одного и того же фермента.

В результате первый тип множественных форм сформирован на генетическом уровне, когда второй - на посттрансляционном.

Значение ферментов

В медицине сводится к выпуску новых лекарственных средств, в составе которых вещества уже находятся в нужных количествах. Ученые еще не нашли способ стимулирования синтеза недостающих энзимов в организме, однако сегодня широко распространены препараты, которые могут на время восполнить их недостаток.

Различные ферменты в клетке катализируют большое количество реакций, связанных с поддержанием жизнедеятельности. Одними из таких энизмов являются представители группы нуклеаз: эндонуклеазы и экзонуклеазы. Их работа заключается в поддержании постоянного уровня нуклеиновых кислот в клетке, удалении поврежденных ДНК и РНК.

Не стоит забывать о таком явлении, как свертывание крови. Являясь эффективной мерой защиты, данный процесс находится под контролем ряда ферментов. Главным из них является тромбин, который переводит неактивный белок фибриноген в активный фибрин. Его нити создают своеобразную сеть, которая закупоривает место повреждения сосуда, тем самым препятствуя излишней кровопотере.

Ферменты используются в виноделии, пивоварении, получении многих кисломолочных продуктов. Для получения спирта из глюкозы могут использоваться дрожжи, однако для удачного протекания этого процесса достаточно и экстракта из них.

Интересные факты, о которых вы не знали

Все ферменты организма имеют огромную массу - от 5000 до 1000000 Да. Это связано с наличием белка в составе молекулы. Для сравнения: молекулярная масса глюкозы - 180 Да, а углекислого газа - всего 44 Да.

На сегодняшний день открыто более чем 2000 ферментов, которые были обнаружены в клетках различных организмов. Однако большинство из этих веществ до конца еще не изучено.

Активность ферментов используется для получения эффективных стиральных порошков. Здесь энзимы выполняют ту же роль, что и в организме: они разрушают органические вещества, и это свойство помогает в борьбе с пятнами. Рекомендуется использовать подобный стиральный порошок при температуре не выше 50 градусов, иначе может пойти процесс денатурации.

По статистике, 20% людей по всему миру страдает от недостатка какого-либо из ферментов.

О свойствах энзимов знали очень давно, однако только в 1897 году люди поняли, что для сбраживания сахара в спирт можно использовать не сами дрожжи, а экстракт из их клеток.

Большинство ферментов представлены в клетках организма в виде множественных молекулярных форм, называемых изоферментами или изоэнзимами . Изоферменты – это сходные по структуре белковые молекулы, способные катализировать одну и ту же биохимическую реакцию, но различающиеся по первичной структуре входящих в их состав полипептидов. Они имеют одинаковую структуру каталитического центра, вследствие чего обладают одним типом субстратной специфичности. Изоферменты одного и того же фермента отличаются оптимумами рН, температуры, других условий внешней среды, по их молярной активности, но все они катализируют одну и ту же реакцию. Когда из клеток организма выделяют какой-либо фермент и определяют его активность, то всегда имеют дело с конкретными изоферментами данного фермента.

Молекулы ферментов чаще всего представляют собой олигомеры, построенные из двух или нескольких полипептидов, которые в той или иной степени различаются первичными структурами, но имеют однотипную третичную структуру и поэтому при взаимодействии образуют функционально родственные белки. Как было показано ранее, различающиеся первичными структурами полипептиды в составе олигомерных молекул кодируются разными генами, в связи с чем природа и набор изоферментов определяются генотипом организма.

Впервые механизм образования изоферментов был выяснен при изучении множественных молекулярных форм фермента лактатдегидрогеназы, катализирующего превращение молочной кислоты в пировиноградную в клетках человека и животных:

СН 3 – СН(ОН) – СООН ¾® СН 3 – С – СООН

В ходе исследований были выделены кристаллические препараты лактатдегидрогеназы из клеток печени, сердечной мышцы и скелетных мышц и подвергнуты разделению методом электрофореза в щелочной буферной системе (рН 8,8). В таких условиях молекулы фермента имеют отрицательный заряд и в зависимости от величины заряда проявляют разную подвижность в направлении к аноду. В процессе электрофоретического разделения было выделено пять белковых фракций, каждая из которых представляла собой тетрамерные молекулы с молекулярной массой около 140 тыс., образованные из различных комбинаций двух типов полипептидов, обозначаемых Н и М . Полипептиды Н наиболее активно синтезируются в сердечной мышце и печени и больше содержат в своем составе остатков моноаминодикарбоновых кислот. Второй тип полипептидов М преимущественно синтезируется в скелетных мышцах и они характеризуются меньшим содержанием дикарбоновых аминокислот. С участием указанных типов полипептидов образуется пять разновидностей ферментных молекул, являющихся изоферментами лактатдегидрогеназы: Н 4 , Н 3 М , Н 2 М 2 , НМ 3 , М 4 . Каждая молекула изофермента как тетрамер состоит из 4 полипептидов, которые могут быть идентичными (Н 4 и М 4 ) или разными (Н 3 М , Н 2 М 2 , НМ 3 ). Количественное содержание каждого изофермента в данной ткани зависит от концентрации в ней полипептидов Н и М .

Вследствие того, что полипептиды Н содержат больше в своем составе остатков дикарбоновых аминокислот, тетрамер Н 4 при рН среды 8,8 имеет наибольший отрицательный заряд, вследствие чего быстрее движется к аноду в процессе электрофореза (рис. 19)

Тетрамер М 4 характеризуется наименьшей подвижностью к аноду, так как его молекулы построены из полипептидов с меньшим содержанием дикарбоновых аминокислот. Другие изоферменты распределяются при электрофорезе между фракциями Н 4 и М 4 в зависимости от числа полипептидов Н и М в их молекулах.

На примере лактатдегидрогиназы мы видим, если молекула фермента - тетрамер, образованный из двух типов полипептидов, то возникают пять изоферментов. Но если молекулы тетрамерного фермента формируются из трех типов полипептидов, например А , Б и В , тогда возникают следующие комбинации полипептидов в молекуле: А 4 , Б 4 , В 4 , А 3 Б , А 3 В , А 2 Б 2 , А 2 В 2 , А 2 БВ , АБ 3 , АВ 3 , АБ 2 В , АБВ 2 , Б 3 В , В 3 Б , Б 2 В 2 . На этом примере видно, что набор изоферментов заметно возрастает при увеличении числа разных полипептидов, из которых строятся молекулы белка–фермента. Набор изоферментов также увеличивается при возрастании степени олигомерности молекулы фермента. Так, у лактатдегидрогиназы из двух разных полипептидов строятся тетрамерные молекулы и возникают 5 изоферментов, а у гексамерного белка из двух типов полипептидов образуются уже семь изоферментов, у октамерного белка – 9 и т.д. Таким образом, общий набор изоферментов данного ферментного белка определяется степенью олигомерности его молекулы и числом разных полипептидов, из которых образуются молекулы белка. Следует отметить, что к изоферментам не относятся молекулы фермента, измененные в результате повреждения структуры белка или модификации его молекул путем присоединения активных группировок (так называемая посттрансляционная модификация белков).

Поскольку изоферменты – это определенный набор белковых молекул, способных катализировать превращение одного и того же субстрата, то для их выявления используют методы разделения, принятые для белков, с последующим определением каталитической активности. Наиболее часто для разделения изоферментов используют метод электрофореза в полиакриламидном геле, который по сравнению с другими методами имеет наиболее высокую разрешающую способность. При разделении этим методом можно выявить изоферменты, различающиеся по суммарному заряду молекулы, который определяется содержанием в белке остатков моноаминодикарбоновых кислот. Если же в составе организма имеются генетические варианты молекул фермента, у которых различия в аминокислотном составе не приводят к изменению заряда молекулы, то для их разделения используют модификации электрофореза, основанные на других принципах, например, изоэлектрофокусирование белков.

Особенно большое разнообразие множественных молекулярных форм наблюдается у растительных ферментов. Практически каждый фермент представлен в растении в виде набора изоферментов, каждый из которых проявляет каталитическую активность в строго определенных условиях, зависящих от внутренней физиологической среды, что позволяет организму обеспечивать специфичность обмена веществ в данном органе, ткани или внутриклеточном компартменте (межклеточном отсеке). Так, например, в листьях и корнях растений разная физиологическая среда, но в них может проходить одна и та же реакция за счет того, что ее катализируют разные изоферменты данного фермента.

В процессе роста и развития растений постоянно изменяется внутренняя физиологическая среда и внешние условия, в соответствии с этим изменяется и набор изоферментов каждого фермента. Особенно заметно наблюдаются качественные и количественные изменения состава изоферментов при созревании и прорастании семян.

На рис. 21 показаны электрофореграммы изоферментов a-амилазы созревающего, зрелого и прорастающего зерна пшеницы, различающихся по их подвижности к аноду. При сравнении электорофореграмм видно, что в созревающем зерне пшеницы амилолитическую активность имеют четыре, изофермента с низкой подвижностью к аноду, а в прорастающем зерне также четыре, но уже других по электрофоретической подвижности изофермента. Вследствие того, что при созревании зерна происходит связывание амилаз белковыми ингибиторами в неактивный комплекс, в полностью созревшем зерне при благоприятных погодных условиях выявляется слабая амилолитическая активность только одного изофермента a-амилазы. Однако в зерновках, сформировавшихся при влажной погоде, активность большинства изоферментов a - амилаз, выявленных в созревающем зерне, сохраняется.

Наличие в клетках организма множественных молекулярных форм одного и того же фермента, проявляющих каталитическую активность при разных физиологических условиях позволяет организму осуществлять с необходимой интенсивностью биохимические процессы при изменении условий внешней среды.

Когда изменяются внешние условия, то они становятся неблагоприятными для проявления каталитической активности определенных изоферментов, но биохимическая реакция не прекращается, так как вступают в действие другие изоферменты, которые способны катализировать данное превращение в изменившихся условиях. Если появляется новый изофермент, то он расширяет диапазон выживаемости организма. Чем больше набор изоферментов, тем шире диапазон их действия и лабильнее происходит адаптация организма к неблагоприятным факторам внешней среды.

Изучение ферментных систем растений показывает, что специфичность обмена веществ у разных генотипов обеспечивается характерным для каждого генотипа набором изоферментов. Чем ближе генотипы растений в систематическом отношении, тем меньше различается у них изоферментный состав ферментов. В связи с этим изоферментный анализ довольно успешно применяется для уточнения систематики живых организмов, выявления филогенетического родства между видами и сортами растений, а также проверки генетической чистоты или, наоборот, генетического разнообразия растительной популяции.

Ферменты, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но отличающиеся по первичной структуре белка, называют изофермен-тами, или изоэнзимами. Они катализируют один и тот же тип реакции с принципиально одинаковым механизмом, но отличаются друг от друга кинетическими параметрами, условиями активации, особенностями связи апофермента и кофермента. Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты. Следовательно, изоферменты различаются по первичной структуре белковой молекулы и, соответственно, по физико-химическим свойствам. На различиях в физико-химических свойствах основаны методы определения изоферментов.

По своей структуре изоферменты в основном являются олигомерными белками. Причём та или иная ткань преимущественно синтезирует определённые виды протомеров. В результате определённой комбинации этих протомеров формируются ферменты с различной структурой - изомерные формы. Обнаружение определённых изоферментных форм ферментов позволяет использовать их для диагностики заболеваний.

Фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты). Повышение активности наблюдают при острых поражениях сердца, печени, почек, а также при мегалобластных и гемолитических анемиях. Однако это указывает на повреждение лишь одной из перечисленных тканей.

Креатинкиназа (КК) катализирует реакцию образования креатинфосфата. Определение активности КК в плазме крови имеет диагностическое значение при инфаркте миокарда (происходит повышение уровня МВ-изоформы). Количество изоформы ММ может повышаться при травмах и повреждениях скелетных мышц. Изоформа ВВ не может проникнуть через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах и диагностического значения не имеет.

10. Органная специфичность изоферментов ЛДГ. Физиологические значения общей активности лактатдегидрогеназы и ее изоферментов в плазме крови. Диагностическая значимость определения активности ЛДГ и ее изоферментов.

Лактатдегидрогеназа является гликолитическим ферментом и катализирует следующую реакцию: Лактат + НАД Лактатдегидрогеназа Пируват + НАДН

Молекула ЛДГ представляет собой тетрамер, состоящий из одного или двух типов субъединиц, обозначаемых как M (мышцы) и H (сердце). В сыворотке крови фермент существует в пяти молекулярных формах, различающихся по первичной структуре, кинетическим свойствам, электрофоретической подвижности (ЛДГ‑1 быстрее движется к аноду по сравнению с ЛДГ‑5, то есть более электрофоретичеки подвижна). Каждая форма имеет характерный полипептидный состав: ЛДГ‑1 состоит из 4 H‑субъединиц, ЛДГ‑2 - из 3 H‑субъединиц и 1 M‑субъединицы, ЛДГ‑3 представляет собой тетрамер из 2 H‑субъединиц и 2 M‑субъединиц, ЛДГ‑4 содержит 1 H‑субъединицу и 3 M‑субъединицы, ЛДГ‑5 состоит только из M‑субъединиц. По степени убывания общей каталитической активности энзима все органы и ткани располагаются в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови.

От того, какой изофермент наиболее представлен, зависит преимущественный способ окисления глюкозы в ткани: аэробный (до CO2 и H2O) или анаэробный (до молочной кислоты). Подобное различие обусловлено разной степенью сродства изоферментов к пировиноградной кислоте. Изоферменты, содержащие в основном H‑субъединицы (ЛДГ‑1 и ЛДГ‑2), обладают низким сродством к пирувату и поэтому неспособны эффективно конкурировать за субстрат с пируватдегидрогеназным комплексом. В результате пируват подвергается окислительному декарбоксилированию и в виде ацетил‑КоA вступает в цикл Кребса.

Напротив, изоферменты, обладающие главным образом M‑субъединицами (ЛДГ‑4 и ЛДГ‑5), имеют более высокое сродство к пирувату и, как следствие, превращают его в молочную кислоту. Для каждой ткани установлены наиболее типичные изоферменты. Для миокарда и мозговой ткани основным изоэнзимом является ЛДГ‑1, для эритроцитов, тромбоцитов, почечной ткани - ЛДГ‑1 и ЛДГ‑2. В легких, селезенке, щитовидной и поджелудочной железах, надпочечниках, лимфоцитах преобладает ЛДГ‑3. ЛДГ‑4 находится во всех тканях с ЛДГ‑3, а также в гранулоцитах и мужских половых клетках, в последних дополнительно обнаруживается ЛДГ‑5. В скелетных мышцах изоферментная активность располагается в порядке убывания в ряду: ЛДГ‑5, ЛДГ‑4, ЛДГ‑3. Для печени наиболее характерен изофермент ЛДГ‑5, выявляется также ЛДГ‑4.

В норме основным источником активности ЛДГ в плазме крови являются разрушающиеся клетки крови. В сыворотке активность изоферментов распределяется следующим образом: ЛДГ‑2 > ЛДГ‑1 > ЛДГ‑3 > ЛДГ‑4 > ЛДГ‑5. При электрофорезе между фракциями ЛДГ‑3 и ЛДГ‑4 иногда обнаруживается дополнительная полоса изофермента ЛДГ‑X, данный изофермент локализован в тех же органах, что и ЛДГ‑5.

Все заболевания, протекающие с разрушением клеток, сопровождаются резким повышением активности ЛДГ в сыворотке крови. Нарастание общей активности фермента обнаруживается при таких заболеваниях как инфаркт миокарда, некротическое поражение почек, гепатит, панкреатит, воспаление и инфаркт легкого, опухоли различной локализации, повреждения, дистрофия и атрофия мышц, гемолитические анемии и физиологическая желтуха новорожденных, лимфогранулематоз, лейкозы. При инфаркте миокарда начало роста активности фермента в сыворотке крови отмечается на 8‑10 час от момента приступа, максимальное увеличение наступает к 24‑48 часу, нередко в 15‑20 раз превышая норму. Повышенная активность ЛДГ сохраняется до 10‑12 суток от начала заболевания. Степень нарастания активности фермента не всегда коррелирует с размерами поражения сердечной мышцы и для прогноза исхода заболевания может являться лишь ориентировочным фактором. У больных стенокардией активность фермента не изменяется, что позволяет применять тест для дифференциальной диагностики в пределах 2‑3 суток после сердечного приступа. Наличие органной специфичности ферментов позволяет применять исследование их активности с целью топической диагностики.

11. Физиологические значения общей активности креатининкиназы (КК) и ее изоферментов в плазме крови. Диагностическая значимость определения активности КК и ее изоферментов.

Креатинкиназа (КК) – это фермент, природный катализатор химических реакций, значительно увеличивающий скорость преобразования креатина и АТФ (аденозинтрифосфат) в высокоэнергетическое соединение креатинфосфат, который расходуется при интенсивных мышечных сокращениях. Данный фермент содержится в цитоплазме клеток различных мышц (сердечной, скелетных), а также в клетках мозга, легких, щитовидной железы.

Молекулу креатинкиназы можно поделить на две части, каждая из которых реализуется в виде отдельной субъединицы: М (мышца), и B (мозг). Данные субъединицы в организме человека могут объединяться вместе тремя способами, образуя, соответственно, три изоформы креатинкиназы: ММ, МВ и ВВ. Эти изоферменты отличаются своей локализацией в организме человека: креатинкиназа ММ расположена в миокарде и скелетных мышцах; креатинкиназа МВ локализована в большей степени в миокарде; креатинкиназа ВВ содержится в клетках плаценты, головного мозга, мочевыводящих путей, некоторых опухолях и других местах.

Нормальная концентрация фермента напрямую зависит от возраста и пола человека. В связи с активным развитием мускулатуры и нервной системы, у детей активность природного катализатора повышена по отношению к активности у взрослых. У женщин креатинкиназа ниже, чем у мужчин.

Уровень изофермента ММ оказывается повышен в большей степени в результате повреждений мышц, и редко при повреждениях сердца. Содержание КК МВ связано с повреждением миокарда. Значительное увеличение активности данной формы наблюдается при инфаркте миокарда. Ее уровень резко возрастает уже через два - четыре часа после первых симптомов. Поэтому концентрация данного фермента в крови активно используется для определения инфаркта миокарда. Однако, стоит отметить, что содержание КК МВ возвращается к нормальному уровню по прошествии трех-шести дней, что обуславливает низкую эффективность диагностики на поздних сроках. Концентрация КК ВВ увеличивается при онкологических заболеваниях. Снижение уровня изоферментов не несет никакой диагностической ценности, так как минимальный порог содержания КК у здорового человека равен нулю.

12. Липазы плазмы крови. Диагностическая значимость определения активности липазы. Липаза - синтезируемый человеческим организмом водорастворимый фермент, катализирующий гидролиз нерастворимых эстеров (липидных субстратов) и способствующий перевариванию, растворению и фракционированию нейтральных жиров. Вместе с желчью липаза стимулирует переваривание жиров, жирных кислот, жирорастворимых витаминов А, Е, D, К, трансформируя их в энергию и тепло. Назначением липопротеинлипазы является расщепление триглицеридов (липидов) в липопротеинах крови, благодаря чему обеспечивается доставка жирных кислот к тканям. Липазу вырабатывают: поджелудочная железа; печень; легкие; кишечник особые железы, расположенные в ротовой полости детей грудного возраста. В последнем случае синтезируется так называемая лингвальная липаза. Каждый из перечисленных ферментов способствует расщеплению определенной группы жиров.

С точки зрения значимости при постановке диагноза важную роль играет липаза, вырабатываемая поджелудочной железой. Повышение уровня фермента отмечается при: панкреатите, протекающем в острой форме, или при обострении хронического процесса; желчных коликах; травме поджелудочной железы; наличии в поджелудочной железе новообразований; хронических патологиях желчного пузыря; образовании кисты или псевдокисты в поджелудочной железе; закупорке панкреатического протока рубцом или камнем; внутрипеченочном холестазе; острой кишечной непроходимости; инфаркте кишечника; перитоните; прободении язвы желудка; перфорации внутреннего (полого) органа; острой или хронической почечной патологии; эпидемическом паротите, при котором происходит поражение поджелудочной железы; нарушениях обменных процессов, имеющих место при сахарном диабете, ожирении или подагре; циррозе печени; длительном приеме медицинских препаратов – в частности, барбитуратов, анальгетиков наркотического ряда, гепарина, индометацина; операции по трансплантации органов. В редких случаях процесс активизации липазы оказывается связанным с некоторыми травмами – например, переломами трубчатых костей. Но в этом случае колебания уровня фермента в крови не могут считаться специфическим показателем наличия физического повреждения. По этой причине анализы на липазу не учитываются при диагностике травм различного происхождения.

Определение уровня липазы в сыворотке обретает особую важность при любом поражении поджелудочной железы. В этом случае анализ крови на содержание данного энзима вместе с анализом на амилазу (фермент, способствующий расщеплению крахмала до олигосахаридов) с высокой степенью достоверности указывает на наличие патологического процесса в тканях поджелудочной железы: оба показателя оказываются выше нормы). В процессе нормализации состояния больного названные ферменты возвращаются к адекватным показателям не одновременно: как правило, уровень липазы остается на высоком уровне дольше, чем уровень амилазы.

Высокий уровень липазы сохраняется от 3 до 7 суток с начала развития воспаления. Тенденция к снижению фиксируется только спустя 7-14 дней.

Низкий уровень липазы фиксируется: при наличии злокачественного новообразования в любой части организма, кроме самой поджелудочной железы; вследствие снижения функции поджелудочной железы; при кистозном фиброзе (муковисцидозе) – генетическом заболевании с тяжелым течением, возникающем в результате патологического поражения желез внешней секреции (ЖКТ, легких). после оперативного вмешательства по удалению поджелудочной железы; при избыточном содержании триглицеридов в крови, возникающем по причине неправильного питания с обилием жирных продуктов в рационе или вследствие наследственной гиперлипидемии. В некоторых случаях снижение уровня липазы является маркером перехода панкреатита в хроническую форму.

ИЗОФЕРМЕНТЫ (син.: множественные формы ферментов, изозимы ) - молекулярные формы (разновидности) определенного фермента, отличающиеся только по физико-химическим свойствам; определение изофермент-ного спектра различных ферментов в сыворотке крови является одним из важных методов клин, энзимодиагностики. И. обнаружены в тканях человека, животных, растений и микроорганизмов. Известно св. 50 ферментов, представленных в виде И. в различных органах и тканях человека, животных и растений.

И. могут отличаться друг от друга по четвертичной структуре, т. е. по характеру и количеству субъединиц, входящих в состав их молекул, по электрофоретической подвижности, адсорбционным свойствам, сродству к субстрату, оптимальному значению pH, субклеточной локализации, специфичности в отношении коферментов (см.) и т. д. Так, напр., большинство органов и тканей человека и животных содержит пять И. лактатдегидрогеназы (ЛДГ), каждый из которых представляет собой различные комбинации из четырех субъединиц двух типов с мол. весом 34 500, условно обозначенных «Н» и «М» (см. Лактатдегидрогеназа). Оба типа субъединиц различаются по аминокислотному составу, последовательности остатков аминокислот в молекуле, иммунохим. и электрофоретическим свойствам. Синтез субъединиц контролируется двумя различными генами. Малатдегидрогеназа (МДГ) представлена в различных тканях человека и животных двумя И., один из которых локализован в митохондриях, а другой - в цитоплазме. Оба эти И. различаются по специфичности в отношении НАД и чувствительности к ингибиторам (напр., оксалату). И. изоцитратдегидрогеназы (ИЦДГ; КФ 1.1.1. 41 и 1.1.1.42) различаются по специфичности к коферментам (НАД и НАДФ), а также по субклеточной локализации: НАД-ИЦДГ локализована в митохондриях, а НАДФ-ИЦДГ и в митохондриях, и в цитоплазме. Митохондриальная и цитоплазматическая НАДФ-ИЦДГ различаются между собой по каталитическим, электрофоретическим и иммунохим. свойствам.

Для идентификации и разделения И. используют различные физ.-хим. методы исследования: различные виды электрофореза (см.), адсорбционную и ионообменную хроматографию (см.), гель-фильтрацию (см.) и др. Наиболее широкое распространение как самый доступный получил метод электрофореза в полиакриламидном геле (диск-электрофорез). Различия в электрофоретических свойствах являются основой для классификации многих И. Для обозначения И. приводится сокращенное название фермента с соответствующим подстрочным порядковым номером, который характеризует электрофоретическую подвижность И. при определенном значении pH. Напр., И. лактатдегидрогеназы обозначаются как ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3 и т. д.

Биол, значение наличия множественных форм ферментов еще не ясно. Предполагают, что И. играют определенную роль в регуляции метаболических процессов в клетке. Возможно, что И. обеспечивают приспособляемость организма к изменениям окружающей среды и обусловливают специфичность обмена, характерную именно для данной ткани. Поэтому многие ферменты, занимающие ключевые позиции в обмене веществ, имеют И. (ЛДГ, МДГ, ферменты, катализирующие окислительное фосфорилирование, различные аминотрансферазы). Возможно, что различные И. одного и того же фермента специфически катализируют прямую или обратную реакции определенной ферментативной реакции (см. Лактатдегидрогеназа). О важной роли И. в тонкой регуляции метаболических процессов свидетельствует изменение их спектра под влиянием ряда воздействий и физиол, факторов (денервации, различных гормонов, охлаждения, гипоксии и др.). Отмечено изменение в характере распределения различных И. в тканях человека и животных в эмбриогенезе. Однако для изученных ферментов пока не найдено специфических эмбриональных форм И.

Спектр И. в количественном и качественном отношении в различных тканях человека и животных различен и часто строго специфичен. Это имеет большое диагностическое значение. Поскольку биосинтез отдельных И. и их субъединиц контролируется различными генами, предполагают, что видоизменение гена влечет за собой появление атипичных И. в тканях и крови. Т. о., возникает возможность использования определения спектров И. для диагностики генетических аномалий. Ряд патол. процессов, особенно дегенеративно-деструктивного характера, связан с изменением проницаемости клеточных мембран, что является причиной изменения спектра И. в сыворотке крови больного. Поэтому определение И. в крови и тканях человека находит все более широкое применение в клинике. Для решения некоторых вопросов диагностики, патогенеза и терапии ряда заболеваний определение изоферментных спектров имеет существенное преимущество по сравнению с определением общей активности того или иного фермента. Наибольшее диагностическое значение имеет определение изофермент-ного спектра ЛДГ, который меняется при инфаркте миокарда (резко повышается активность ЛДГ1 и ЛДГ2). Изменения спектра И. ЛДГ в сыворотке крови сохраняются дольше, чем изменения суммарной активности фермента, и могут обнаруживаться тогда, когда общая активность ЛДГ возвращается к норме. Отклонения спектра И. ЛДГ от нормы отмечены при заболеваниях гепатобилиарной системы, при мышечных дистрофиях, опухолевых заболеваниях, остром лейкозе, патол, процессах в легких (острые очаговые и крупозная пневмонии, обострение хрон, пневмонии и др.)*

Диагностическим тестом служат также изменения спектров И. и других ферментов, напр, значительное увеличение катодных фракций МДГ (в особенности митохондриальной фракции) в сыворотке крови больных циррозом печени но сравнению с сывороткой крови больных хрон, гепатитом. Определение спектра И. и общей активности МДГ в крови находит широкое применение для диагностики и оценки тяжести асфиксии у новорожденных. Изменения активности И. кислой фосфатазы отмечаются при болезни Гоше (см. Гоше болезнь), раке предстательной железы и множественной миеломе. Для диагностики ряда заболеваний печени используют определение спектра И. щелочной фосфатазы (см. Фосфатазы).

Определение И. аминотрансфераз (см.) также имеет диагностическую ценность. В печени, почках, сердечной мышце человека обнаруживаются два И. аспартат-аминотрансферазы (КФ 2.6.1.1; АсАТ). Один из них локализуется в митохондриях, другой - в цитоплазме клеток. Ок. 79% всей активности АсАТ приходится на долю митохондриального И. и лишь 21% на долю цитоплазматического. При тяжелом течении болезни Боткина в сыворотке крови обнаруживается два И. АсАТ, тогда как в норме и при легком течении заболевания - только один.

При повреждениях скелетной мускулатуры, а также при инфаркте миокарда в сыворотке крови повышается активность креатинкиназы (см.), а также изменяется спектр ее И.

Библиография: Генетика изоферментов, под ред. Д. К. Беляева, М., 1977, библиогр.; Иванов И. И., Коровки н Б. Ф. и М а р к e л о в И. М. Введение в клиническую энзимологии), Л., 1974, библиогр.; Комаров Ф. И., Коровкин Б. Ф. и Меньшиков В. В. Биохимические исследования в клинике, Л., 1976; Ленинджср А. Биохимия, пер. с англ., с. 217 и др., М., 1976; Проблемы медицинской химии, под ред. В. С. Шапота и Э. Г. Ларского, с. 5, М., 1973; У и л к и н с о н Д. Изоферменты, пер. с англ., М., 1968; Успехи биологической химии, под ред. В. Л. Кретовича и др., т. 9, с. 55, М., 1972; Enzyme nomenclature, Amsterdam, 1965; К а р 1 a n N. О. Symposium on multiple forms of enzymes and control mechanisms, Bact. Rev., "v. 27, p. 155, 1963; Latner A. L. Isoenzymes, Advanc. clin. Chem., v. 9, p. 69, 1967.

Л. В. Павлихина.