У дома

Ливневневка

Хемилуминесцентен метод за определяне на антиоксиданти (АО). Метод за определяне на общата антиоксидантна активност Определяне на антиоксидантната активност на меда чрез хемилуминесценция

Хемилуминесцентен метод за определяне на антиоксиданти (АО). Метод за определяне на общата антиоксидантна активност Определяне на антиоксидантната активност на меда чрез хемилуминесценция

Изобретението се отнася до хранително-вкусовата промишленост и може да се използва за определяне на общата антиоксидантна активност. Методът се провежда по следния начин: анализираното вещество взаимодейства с реагента 0,006 М Fe(III) - 0,01 М о-фенантролин. Аскорбиновата киселина (АК) взаимодейства със същия реагент, който се добавя в съотношение 1:100. След това се инкубира най-малко 90 минути и се фотометрира при 510±20 nm. След това се установява зависимостта на стойността на аналитичния сигнал от количеството на веществото и се изчислява стойността на общия АОА. Представеният метод позволява по-малко времеемко и по-надеждно определяне на общата антиоксидантна активност на растителни суровини и хранителни продукти, базирани на него. 2 т.п. f-ly, 1 ил., 5 табл.

Изобретението се отнася до аналитичната химия и може да се използва за определяне на общата антиоксидантна активност (АОА) на растителни суровини и хранителни продукти на базата им.

Известен кулонометричен метод за определяне на общата AOA на чай, основан на взаимодействието на водни екстракти от продукта с електрически генерирани бромни съединения (I.F. Abdulin, E.N. Turova, G.K. Budnikov. Химия, 2001, том 56, № 6, стр. 627-629). Изборът на електрогенерирани бромни съединения като титрант се дължи на способността им да влизат в различни реакции: радикал, редокс, електрофилно заместване и добавяне чрез множество връзки. Това дава възможност да се обхване широк спектър от биологично активни съединения на чая с антиоксидантни свойства. Недостатъците на метода са възможността за реакция на бромиране с вещества, които не са антиоксиданти, и изразяването на получената стойност на общия AOA в единици количество електричество (kC/100 g), което затруднява оценката резултатите.

Известен волтаметричен метод за определяне на общата антиоксидантна активност чрез относителната промяна в тока на електроредукция на кислород в диапазона на потенциала от 0,0 до -0,6 V (отн. нас. c.s.e.) върху електрод с живачен филм (пат. 2224997, Русия IPC 7 G 01 N 33/01 Волтаметричен метод за определяне на общата активност на антиоксиданти / E. I. Korotkova, Yu. Недостатъкът на този метод е появата на странични електрохимични реакции, което намалява ефективността на определяне на антиоксиданти, което води до намаляване на надеждността на резултатите.

Известен метод за контролиране на общия AOA на профилактични и терапевтични антиоксидантни агенти за липидна пероксидация до малонов алдехид със спектрофотометрично или хемилуминесцентно откриване (пат. 2182706, Русия, IPC 7 G 01 N 33/15, 33/52. средства / Pavlyuchenko I.I., Басов А.А., Федосов С.Р. - № 2001101389/14; заявление 15.01.2001 г.; публикувано 20.05.2002 г.). В същото време антиоксидантната активност е обратно пропорционална на нивото на продуктите на липидната пероксидация. Недостатъкът на този метод може да се счита за ограничен кръг от анализирани обекти, тъй като при тези условия се определят антиоксиданти само от една група, липиди.

Известен метод за определяне на общия AOA на растителен екстракт, който се състои в инкубиране на екстракта с линетол и железен (II) сулфат, иницииране на реакцията на окисление чрез UV облъчване и последващо взаимодействие с тиобарбитурова киселина в присъствието на тритон X-100 ( Приложение 97111917/13, Русия, IPC 6 G 01 N 33/00 Метод за определяне на общата антиоксидантна активност / Рогожин В.В. При извършване на спектрофотометрия се използва смес от етанол и хлороформ в съотношение 7:3. Стойността на AOA на биологичен материал се определя от съотношението на натрупването на реакционния продукт - малондиалдехид в проба, съдържаща екстракт, към проба с прооксидант. Недостатъкът на този метод е възможността за странични реакции по време на ултравиолетово облъчване, което намалява надеждността на резултатите от анализа.

Изброените методи за определяне на общата AOA имат редица недостатъци: висока трудоемкост, ниска надеждност, измерената стойност на общата AOA не е свързана и не е сравнима с никое конвенционално вещество.

Най-близкият аналог на претендираното изобретение е метод за определяне на общата AOA на лечебни растения чрез измерване на хемилуминесценцията, която възниква при взаимодействие с луминол в присъствието на окислител водороден пероксид (M.Kh. Canary grass чрез хемилуминесценция // Journal of Аналитична химия, 2004, V.59, No. 1, P.84-86). За количествена оценка на общия AOA се сравнява редуциращата способност на екстракта от лекарствени суровини и активността на мощен антиоксидант - аскорбинова киселина в количество 25-110 μg. В сравнение с горните методи, в прототипа водородният пероксид се използва като окислител, който взаимодейства с широк спектър от антиоксиданти и измерената стойност на общия AOA на обекта се определя и изразява спрямо аскорбиновата киселина, която е обикновен антиоксидант, който прави възможно получаването на надеждни резултати при запазване на други недостатъци. Недостатъците също включват сложността на оборудването, използвано в метода.

Техническата цел на заявеното изобретение е разработването на по-малко времеемък и надежден метод за определяне на общата антиоксидантна активност на растителни суровини и хранителни продукти, базирани на него.

За решаване на техническия проблем се предлага взаимодействие на аналита с реагента 0,006 M Fe (III) - 0,01 M о-фенантролин и аскорбинова киселина (AA) със същия реагент, който се добавя в съотношение 1:100 , инкубирани най-малко 90 минути, фотометрирани при 510±20 nm, последвано от установяване на зависимостта на аналитичния сигнал от количеството на веществото и изчисляване на общата AOA. По-специално, изчислението може да се извърши съгласно формула (I), получена от уравнението на количественото съответствие между обекта на изследване и аскорбиновата киселина:

където a, b са коефициентите в регресионното уравнение за зависимостта на аналитичния сигнал от количеството на АК;

а", в" - коефициенти в регресионното уравнение за зависимостта на аналитичния сигнал от количеството на изследвания обект;

х слънце. - маса на изследвания редуциращ агент (проба), mg.

Използването на предложения реагент при тези условия ни позволи да разширим линейния диапазон и да намалим долната граница на определените количества аскорбинова киселина. Предложеният набор от основни характеристики ви позволява да определите общия AOA на широка гама от растителни материали и хранителни продукти въз основа на него.

Уравненията на количественото съответствие свързват зависимостта на аналитичния сигнал от количеството на аскорбиновата киселина и зависимостта на аналитичния сигнал от количеството на изследвания обект, при условие че антиоксидантната активност е еднаква.

След обработка на резултатите от фотометричните измервания на величината на аналитичния сигнал по метода на най-малките квадрати (K. Derffel Statistics in analytical chemistry. - M .: "Mir", 1994. S. 164-169; A.K. Charykov Математическа обработка на резултати от химичен анализ - L .: Chemistry, 1984. S.137-144) тези зависимости са описани с линейна регресионна функция: y=ax+b, където a е коефициентът на регресия, b е свободен член. Коефициентът a в регресионното уравнение е равен на тангенса на наклона на правата спрямо оста x; коефициент b - разстоянието по оста y от началото (0,0) до първата точка (x 1 , y 1).

Коефициентите a и b се изчисляват по формулите:

Регресионното уравнение за зависимостта на AS от количеството аскорбинова киселина в даден момент има формата:

y AK \u003d a x AK (mg) + b,

регресионно уравнение за зависимостта на AS от количеството на обекта, който се изследва (редуциращ агент):

y VOST \u003d a "x VOST (mg) + b",

където за AK, за VOST е оптичната плътност на фотометричния разтвор;

x AK (mg), x VOST (mg) - концентрация на аскорбинова киселина (редуциращ агент) в разтвор;

след това, чрез приравняване на стойностите на функциите, получаваме формула (I) за изчисляване на антиоксидантната активност на изследвания обект в единици количество (mg) аскорбинова киселина.

На чертежа е показана зависимостта на аналитичния сигнал от количеството редуциращ агент.

Оптичната плътност на анализираните разтвори е измерена на фотоелектричен колориметър KFK-2MP.

Известно е (F. Umland, A. Yasin, D. Tirik, G. Vunsch Комплексни съединения в аналитичната химия - М.: Мир, 1975. - 531 с.), че о-фенантролинът образува водоразтворим хелат с желязо ( II) червено-оранжев цвят, който се характеризира с максимум на абсорбция при λ=512 nm. Следователно в предложения метод фотометрията се извършва при λ=510±20 nm.

Оптимизирането на състава на реагента и количеството му, въведено в реакцията, се извършва въз основа на резултатите от многофакторното планиране на експеримента с помощта на метода на латинския квадрат, който се състои в промяна на всички изследвани фактори във всеки експеримент и всеки ниво на всеки фактор само веднъж отговаря на различни нива на други фактори. Това ви позволява да идентифицирате и оцените ефекта, причинен от всеки изследван фактор поотделно.

Използвани са следните фактори: количествата Fe(III), о-фенантролин и обемът на въведения в реакцията реагент. Комбинацията от фактори трябва да осигури широк диапазон на линейност на аналитичния сигнал (AS) с достатъчна чувствителност, от една страна, и стабилност на реагента във времето, от друга. Това даде възможност да се отделят следните нива за всеки фактор:

количеството Fe(III): 0.003 M (A 1); 0,006 М (А 2); 0,009 М (А 3);

количество о-фенантролин: 0,01 М (В 1); 0.02 М (В 2); 0.03 М (В 3);

обем на реагента: 0,5 ml (C 1); 1.0 ml (С 2); 2.0 ml (С 3) (Таблица 1).

За да се избере оптималната комбинация от факторни нива, се получават калибрационни зависимости на AS от количеството аскорбинова киселина в диапазона от 10 до 150 μg (което е необходимо за потвърждаване на линейността на функцията), регресионното уравнение на получената зависимост беше изчислена и след това стойността на AS при дадено количество (120 μg) аскорбинова киселина. Така за всеки състав на реагента (фактори А, В) е избран обемът (фактор С), при който стойността на АС е максимална. Това направи възможно намаляването на броя на разглежданите комбинации до девет (Таблица 2).

Сравнявайки общия AS за всяко ниво, бяха идентифицирани количествата с максимална стойност: ΣA 2 (0,991); ΣB 1 (1,066); ΣC 2 (1,361). Това дава възможност да се заключи, че съставът на реагента е оптимален: 0,006 М Fe (III) - 0,01 М о-фенантролин с неговия обем, въведен в реакцията, 1,0 ml на 100 ml разтвор.

При оптимална концентрация на реагента изследвахме промяната в зависимостта на AS от концентрацията на аскорбинова киселина и някои редуциращи агенти, често срещани в природни обекти (танин, рутин, кверцетин) при различни времена на инкубация на реакционната смес (30, 60 , 90, 120 минути). Установено е, че за всички изследвани редуциращи агенти зависимостта на АС от съдържанието им е линейна в границите 10-150 μg (виж чертежа), а стойността на АС зависи от времето на инкубация (табл. 3).

От чертежа се вижда, че промяната на АС под действието на рутина е незначителна, танинът се доближава, а кверцетинът надвишава същата зависимост за аскорбиновата киселина. При разглеждане на промяната в AC от времето на инкубация за всички изследвани редуциращи агенти (Таблица 3) беше установено, че стабилизирането на аналитичния сигнал във времето се наблюдава от 90 минути.

Таблица 3 Промяна в AS на редуциращите агенти във времето
Тествано вещество	m вещества, mg / cm3	Аналитичен сигнал
Тествано вещество	m вещества, mg / cm3	Време на инкубиране на реакционната смес, мин
30	60	90	120
Витамин Ц	10	0,038	0,042	0,044	0,044
100	0,340	0,352	0,360	0,363
танин	10	0,029	0,037	0,042	0,043
100	0,280	0,295	0,303	0,308
Рутин	10	0,013	0,016	0,019	0,019
100	0,150	0,166	0,172	0,175
кверцетин	10	0,031	0,044	0,051	0,053
100	0,420	0,431	0,438	0,442

За доказване на сумиращия характер на определената стойност на AOA е изследвано влиянието на реагента Fe (III) - о-фенантролин върху моделни разтвори, включващи редуциращи агенти: танин, рутин, кверцетин и аскорбинова киселина в различни съотношения. Таблица 4 представя резултатите от анализа на моделни смеси.

Таблица 4 Резултати от анализа на моделни смеси (P=0.95; n=3)
Броят на компонентите в сместа	Общ AOA, изчислен, mcgAA	Обща AOA, намерена, mcgAA
въведени	Общ AOA, изчислен, mcgAA	Обща AOA, намерена, mcgAA	по отношение на АК
АК	танин	Рутин	кверцетин	АК	танин	Рутин	кверцетин
-	20	20	20	-	16,77	9,56	32,73	59,06	57,08
-	10	10	10	-	8,35	4,77	16,41	29,53	26,95
-	50	10	10	-	42,02	4,77	16,41	63,20	55,04
-	10	50	10	-	8,35	23,93	16,41	48,69	50,06
-	10	10	50	-	8,35	4,77	81,70	94,82	91,61
-	30	10	10	-	25,19	4,77	16,41	46,37	39,24
-	10	30	30	-	8,35	14,35	49,06	71,76	73,47
20	20	20	20	20	16,77	9,56	32,73	79,06	96,29
50	10	10	10	50	8,35	4,77	16,41	87,95	93,07
10	50	10	10	10	42,02	4,77	16,41	73,20	78,15
10	10	50	10	10	8,35	23,93	16,41	58,69	78,74
10	10	10	50	10	8,35	4,77	81,70	104,82	121,45
30	30	10	10	30	25,19	4,77	16,41	76,37	84,59
10	10	30	30	10	8,35	14,35	49,06	81,76	103,31

Изчисляването на теоретичната стойност на общия AOA се извършва съгласно уравненията на количественото съответствие, характеризиращи антиоксидантния капацитет на изследвания редуциращ агент по отношение на аскорбиновата киселина, при условия на еднаква антиоксидантна активност: .

Стойността на експерименталната (намерената) АОА се изчислява с помощта на осредненото регресионно уравнение за зависимостта на АС от количеството аскорбинова киселина. От резултатите, представени в таблица 4, се вижда, че експериментално получените стойности на AOA съвпадат задоволително с теоретично изчислените.

По този начин определената стойност на AOA е общ показател и определянето на стойността му с помощта на уравненията на количественото съответствие е правилно.

Предложеният метод е тестван върху реални проби. За да се определи общата AOA на реална проба или нейния екстракт, бяха получени калибрационни зависимости на AS от количеството на аналита и аскорбиновата киселина при време на инкубация на реакционната смес от най-малко 90 минути. Изчисляването на общата АОА се извършва съгласно формула (I) и се изразява в mg аскорбинова киселина на грам от тестовия обект (mgAA/g).

За да се потвърди коректността на предложения метод, тези проби са тествани по известни методи, като се оценява съдържанието на аскорбинова киселина (ГОСТ 24556-89 Продукти от плодове и зеленчуци, преработени. Методи за определяне на витамин С) и преобладаващите редуциращи агенти: в чай - танин (ГОСТ 19885-74 Чай. Методи за определяне на съдържанието на танин и кофеин), в шипки - количеството на органични киселини (ГОСТ 1994-93 Шипки. Спецификации) (таблица 5).

Ключови думи

свободен радикал/антиоксидант/ антиоксидантна активност / общ антиоксидантен капацитет / хемилуминесценция/ луминол / свободен радикал / антиоксидант / антиоксидантна активност / общ антиоксидантен капацитет / хемилуминесценция / луминол

анотация научна статия по химически науки, автор на научна статия - Георги Константинович Владимиров, Е. В. Сергунова, Д. Ю. Измайлов, Ю. А. Владимиров

Лечебните растителни суровини са един от източниците на антиоксиданти за човешкия организъм. Сред методите за определяне на съдържанието на антиоксиданти в растителни обекти е широко разпространен методът на хемилуминесцентния анализ. В настоящата работа той беше използван за оценка общ антиоксидантен капацитет(OAU) отвари от плодове на офика, шипка и глог и запарка от плодове на малина. Кинетиката беше записана в експеримента хемилуминесценцияв система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден прекис и луминол. Концентрациите и обемите на системните компоненти в пробата бяха избрани така, че силните антиоксиданти (аскорбинова киселина) и умерено силните антиоксиданти (кверцетин) да бъдат напълно окислени по време на времето за измерване (10 минути). Предложен е и е обоснован метод за изчисляване на TAU въз основа на промяна в светлинната сума. хемилуминесценцияпри наличие на растителни проби. Кинетичен анализ хемилуминесценцияпоказа, че в изследваните обекти преобладават антиоксиданти със средна сила, включително флавоноиди и слаби антиоксиданти (токоферол и др.). Сравнението на изчислените стойности на TAU за изследваните обекти и данните от техния химичен анализ показа, че продуктите, съдържащи едно и също количество антиоксиданти с различни съотношения по видове, могат да се различават по способността си да защитават организма от вредното въздействие на свободните радикали. Описаната техника е обещаваща за изследване на растителни обекти, съдържащи смес от различни видове антиоксиданти.

Свързани теми научни трудове по химични науки, автор на научна статия - Георгий Константинович Владимиров, Е. В. Сергунова, Д. Ю. Измайлов, Ю. А. Владимиров

2016 / Георгий Владимиров, Сергунова Е.В., Измайлов Д.Ю., Владимиров Ю.А.
Определяне на антиоксиданти чрез активирана хемилуминесценция с използване на 2,2"-азо-бис(2-амидинопропан)
2012 / Алексеев А.В., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А.
Антиоксидантно действие на дихидрокверцетин и рутин при пероксидазни реакции, катализирани от цитохром с
2008 / Демин Е.М., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А.
Оценка на окислителния и антиоксидантния капацитет на биологичните субстрати чрез хемилуминесценция, индуцирана от реакцията на Fenton
2016 / Пискарев Игор Михайлович, И.П. Иванова
Определяне на съдържанието на липохидропероксиди в липопротеините в кръвния серум с помощта на системата микропероксидаза-луминол
2011 / Теселкин Юрий Олегович, Бабенкова Ирина Владимировна
Методи за изследване на антиоксидантите
2004 / Хасанов В. В., Рижова Г. Л., Малцева Е. В.
Антиоксидантна активност на растения, използвани в етномедицината на Тува
2012 / Чехани Н.Р., Теселкин Ю.О., Павлова Л.А., Козин С.В., Любицки О.Б.
Изследване на антиоксидантните свойства на Фоспренил в различни биологични тестови системи
2017 / А. В. Санин, А. Н. Наровлянски, А. В. Пронин, Т. Н. Кожевникова, В. Ю. Санина, А. Д. Агафонова
Влияние на различни дози полихлорирани бифенили върху състоянието на спонтанна и имуноглобулин-индуцирана луминол-зависима хемилуминесценция на цяла кръв
2016 / Габдулхакова И.Р., Каюмова А.Ф., Самоходова О.В.
Оценка на системата на липидната пероксидация на антиоксидантната защита при деца с есенциална артериална хипертония чрез спектрофотометрични и хемилуминесцентни методи
2014 / Натяганова Лариса Викторовна, Гаврилова Оксана Александровна, Колесникова Лариса Романовна

Хемилуминесцентно определяне на общия антиоксидантен капацитет в лекарствен растителен материал

Лечебната растителна суровина е един от източниците на антиоксиданти за човешкия организъм. Хемилуминесцентният анализ е един от често срещаните методи за определяне на съдържанието на антиоксиданти в растителни материали. В нашата работа хемилуминесцентният анализ беше използван за определяне на общия антиоксидантен капацитет (TAC) на плодови отвари от планинска пепел, роза и глог, както и инфузия на малинови плодове. Експериментите установяват кинетиката на хемилуминесценцията на система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден прекис и луминол. Концентрациите и обемите на компонентите на системата бяха избрани така, че силните антиоксиданти (аскорбинова киселина) и антиоксидантите със средна сила (кверцетин) бяха напълно окислени по време на измерването (10 минути). Предложен и обоснован е метод за изчисляване на TAC, базиран на промените в хемилуминесцентната светлинна сума в присъствието на растителни проби. Анализът на кинетиката на хемилуминесценцията показа, че в изследваните обекти преобладават антиоксиданти със средна сила, включително флавоноиди и слаби антиоксиданти (токоферол и други). Сравнението на изчислените стойности на TAC за изследваните обекти и данните от техния химичен анализ показаха, че продуктите, съдържащи едно и също количество антиоксиданти с различно съотношение на антиоксиданти по видове, могат да варират в способността си да защитават тялото срещу вредното въздействие на свободните радикали. . Описаната техника е обещаваща за изследване на растителни обекти, съдържащи смес от различни видове антиоксиданти.

Текстът на научната работа на тема "Хемилуминесцентен метод за определяне на общия антиоксидантен капацитет в лечебни растителни суровини"

Хемилуминесцентен метод за определяне на общия антиоксидантен капацитет в лекарствени растителни материали

Г. К. Владимиров1^, Е. В. Сергунова2, Д. Ю. Измайлов1, Ю. А. Владимиров1

1 Катедра по медицинска биофизика, Факултет по фундаментална медицина, Московски държавен университет "Ломоносов", Москва

2 Катедра по фармакогнозия, Факултет по фармация,

I. M. Sechenov Първи Московски държавен медицински университет, Москва

Лечебните растителни суровини са един от източниците на антиоксиданти за човешкия организъм. Сред методите за определяне на съдържанието на антиоксиданти в растителни обекти е широко разпространен методът на хемилуминесцентния анализ. В настоящата работа той беше използван за оценка на общия антиоксидантен капацитет (TOA) на отвари от плодове на офика, дива роза и глог и запарка от плодове на малина. В експеримента кинетиката на хемилуминесценцията е записана в система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден пероксид и луминол. Концентрациите и обемите на системните компоненти в пробата бяха избрани така, че силните антиоксиданти (аскорбинова киселина) и умерено силните антиоксиданти (кверцетин) да бъдат напълно окислени по време на времето за измерване (10 минути). Предложен е и е обоснован метод за изчисляване на RAE, базиран на промяната в хемилуминесцентната светлинна сума в присъствието на растителни проби. Анализът на кинетиката на хемилуминесценцията показа, че в изследваните обекти преобладават умерено силни антиоксиданти, включително флавоноиди, и слаби антиоксиданти (токоферол и др.). Сравнението на изчислените стойности на TAU за изследваните обекти и данните от техния химичен анализ показа, че продуктите, съдържащи едно и също количество антиоксиданти с различни съотношения по видове, могат да се различават по способността си да защитават организма от вредното въздействие на свободните радикали. Описаната техника е обещаваща за изследване на растителни обекти, съдържащи смес от различни видове антиоксиданти.

Ключови думи: свободен радикал, антиоксидант, антиоксидантна активност, общ антиоксидантен капацитет, хемилуминесценция, луминол

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Руската научна фондация, грант № 14-15-00375.

Ex3 Адрес за кореспонденция: Георгий Константинович Владимиров

119192, Москва, Ломоносовски пр-т, 31, сграда 5; [имейл защитен]

Статията е получена: 10.03.2016 г. Статията е приета за публикуване: 18.03.2016 г.

хемилуминесцентно определяне на общия антиоксидантен капацитет в лекарствен растителен материал

1 Катедра по медицинска биофизика, Факултет по фундаментална медицина, Московски държавен университет "Ломоносов", Москва, Русия

2 Катедра по фармакогнозия, Факултет по фармация,

Първият Московски държавен медицински университет "Сеченов", Москва, Русия

Финансиране: тази работа беше подкрепена от Руската научна фондация, грант №. 14-15-00375.

Благодарности: авторите благодарят на Андрей Алексеев от Московския държавен университет „Ломоносов“ за съдействието му при провеждането на експеримента. Адрес за кореспонденция: Георги Владимиров

Ломоносовски проспект, д. 31, к. 5, Москва, Русия, 119192; [имейл защитен]Получено: 10.03.2016 г. Прието: 18.03.2016 г.

Генерираните в организма свободни радикали нарушават структурата на клетъчните мембрани, което от своя страна води до развитието на различни патологични състояния. Разрушителният окислителен ефект на радикалите се предотвратява от антиоксидантната защитна система на организма, в която важна роля играят съединенията с ниско молекулно тегло - ловци на радикали (капани). Един от източниците на антиоксиданти са лечебните растителни суровини, както и препаратите на тяхна основа, изследването на антиоксидантния потенциал на които спомага за повишаване на техния превантивен и терапевтичен ефект.

Основните методи за определяне на антиоксидантите се разглеждат в произведенията, но определението на антиоксидантите като химични съединения не дава пълна картина на защитните свойства на обекта, който се изследва: те се определят не само от количеството на един или друг антиоксидант , но и от дейността на всеки от тях. Антиоксидантната активност или антиоксидантната активност, AOA, е константата на скоростта на реакцията на антиоксидант със свободен радикал (kInH). Методът на хемилуминесценцията (CL) позволява да се определи общото количество радикали, които антиоксидантите свързват в пробата (общ антиоксидантен капацитет, TAU), а когато се използва методът на математическото моделиране на кинетиката на CL, също и скоростта на образуване и реакция на радикали с антиоксиданти, тоест AOA.

В присъствието на молекулярен кислород алкилният радикал R^ образува пероксилен радикал ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv От LH, чрез образуването на междинни вещества (луминол хидропероксид и луминол ендопероксид), се образува молекула на крайния продукт от окислението на луминол, аминофталова киселина, в електронно възбудено състояние, което излъчва фотон и в резултат на това се наблюдава хемилуминесценция. Интензитетът на CL е пропорционален на скоростта на производство на фотони, която от своя страна е пропорционална на стационарната концентрация на LH в системата. Взаимодействайки с радикалите, антиоксидантите прекъсват описаната верига от трансформации и предотвратяват образуването на фотон.

Съединенията, подложени на термолиза, не са единственият възможен източник на радикали при анализа на антиоксидантния капацитет на пробата по хемилуминесцентния метод. Алтернативи са системи пероксидаза от хрян-водороден пероксид, хемин-водороден пероксид, цитохром с-кардиолипин-водороден пероксид и др. Схемата на реакциите на окисление на луминол от пероксидази се разглежда в работата на Cormier et al. .

Интензитетът на CL е или постоянен, или бавно намалява. Документът описва два подхода за измерване на общия антиоксидантен капацитет, които вземат предвид тази характеристика на кривите. Методът TRAP (Общ реактивен антиоксидантен потенциал) се основава на измерване на латентния период на CL t и може да се използва за определяне на антиоксиданти като тролокс или аскорбинова киселина: те се характеризират с висока константа на скоростта на реакция с радикали и поради тази причина могат се наричат силни антиоксиданти. През латентния период настъпва пълното им окисление. Методът TAR (обща антиоксидантна реактивност) измерва степента на потушаване на хемилуминесценцията q в платото или в максимума на кривата на хемилуминесценцията:

където I е интензитетът на хемилуминесценцията без антиоксидант, а 11 е интензитетът на CL в присъствието на антиоксидант. Този метод се използва, ако системата съдържа предимно слаби антиоксиданти с ниски скоростни константи на взаимодействие с радикалите - много по-ниски в сравнение с луминоловата константа.

Действието на антиоксидантите се характеризира не само с показатели t и c. Както се вижда от произведенията, действието на такива антиоксиданти като пикочна киселина в системата хемин-Н202-луминол или токоферол, рутин и кверцетин в системата на цитохром с-кардиолипин-Н202-луминол се характеризира с промяна в максималната скорост на CL нарастване (utx). Както показват резултатите от математическото моделиране на кинетиката, стойностите на константите на скоростта на взаимодействие на тези антиоксиданти с радикали са близки до стойността на луминолната константа, следователно такива антиоксиданти могат да се нарекат антиоксиданти със средна сила.

DE = DE0 - DE,

където DE0 и DE5 са CL светлинни суми за дадено време? съответно в контролните и опитните проби. Времето трябва да е достатъчно за окисляването на всички антиоксиданти в системата, т.е. CL кривата на тестовата проба да достигне нивото на CL кривата на контролната проба. Последното предполага, че изследователите трябва не само да записват светлинната сума на луминесценцията, но и да записват кривата на кинетиката на CL за достатъчно дълго време, което не винаги се прави.

Тъй като всички измерени показатели зависят от инструмента и условията на измерване, антиоксидантният ефект на дадено вещество в изследваната система обикновено се сравнява с ефекта на антиоксидант, взет като стандарт, например Trolox.

Системата хрян пероксидаза-водороден пероксид е използвана за анализ на общия антиоксидантен капацитет на растителни материали от много автори. В работата, за да се оцени количеството антиоксиданти в пробите, е използван латентният период на CL (TRAP метод), а в работата е използвана площта под кривата на развитие на CL. Тези произведения обаче не дават ясна обосновка

изборът на един или друг параметър за оценка на OAU.

Целта на изследването беше да се определи как съотношението на антиоксиданти от различни видове влияе на TAU и да се модифицира хемилуминесцентният метод по такъв начин, че да може по-точно да се определи TAU в растителни материали. За целта сме си поставили няколко задачи. Първо, да се сравни кинетиката на CL на изследваните обекти с кинетиката на стандартни антиоксиданти от три вида (силен, среден и слаб), за да се разбере кой тип антиоксиданти имат основен принос за TAE на изследваните обекти. Второ, да се изчисли TAE на изследваните обекти чрез измерване на намаляването на светлинната сума на CL под действието на тези обекти в сравнение с действието на антиоксиданта, който осигурява най-голям принос към TAE.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Обект на изследването бяха промишлени проби от плодове на глог, планинска пепел и дива роза, произведени от Krasnogorskleksredstva JSC (Русия), както и плодове от малини, събрани от авторите в Московска област в условия на естествен растеж и изсушени при температура 60 ° C. -80 ° C, докато спрат да изолират деформации от сок и налягане.

Реагентите за анализ на антиоксидантния капацитет по хемилуминесцентния метод са: KH2PO4, 20 mM буферен разтвор (рН 7,4); пероксидаза от корени на хрян (активност 112 U/mg, М = 44 173.9), 1 mM воден разтвор; луминол (5-амино-1,2,3,4-тетрахидро-1,4-фталазиндион, хидразид на 3-аминофталова киселина, М=177.11), 1 mM воден разтвор; водороден пероксид (H2O2, М = 34.01), 1 mM воден разтвор; разтвори на антиоксиданти (аскорбинова киселина, кверцетин, токоферол). Всички реагенти са произведени от Sigma Aldrich (САЩ).

Отвари от плодове на глог, планинска пепел и шипка и инфузия от плодове на малина са приготвени по методологията на Държавната фармакопея на СССР, изложена в общата фармакопейна статия "Настойки и отвари".

Общият антиоксидантен капацитет се определя чрез записване на хемилуминесценция на хемилуминометър Lum-100 (DISoft, Русия) с помощта на софтуер PowerGraph 3.3. За определяне на TAU в растителни суровини, 40 µl луминол в концентрация 1 mM, 40 µl пероксидаза от хрян в концентрация 0,1 µM, от 10 до 50 µl отвара или инфузия (в зависимост от концентрацията) и фосфатен буфер в количеството, необходимо за достигане на общия обем на пробата до 1 ml. Кюветата беше инсталирана в устройството и CL беше записан, като се наблюдава фоновият сигнал. След 48 s регистрация на фоновия сигнал към кюветата се добавят 100 μl H2O2 при концентрация 1 mM и CL регистрацията продължава 10 минути. Приготвени са четири проби с различна концентрация на всеки от растителните обекти. CL също беше записан за разтвори на аскорбинова киселина, кверцетин и токоферол при пет различни концентрации за всеки от антиоксидантите. Впоследствие TAU на пробите от отвари и настойки беше преизчислено за кверцетин.

достигна плато, което показва пълното унищожаване на антиоксидантите в системата. Разрежданията на изследваните проби и концентрациите на разтвори на стандартни антиоксиданти (посочени в надписите към фигурите) са избрани по такъв начин, че всички CL кинетични криви да бъдат измерени при една и съща чувствителност на инструмента.

Антиоксидантният капацитет се изчислява от промяната в площта (AS) под кинетичната крива на хемилуминесценцията (светлинна сума) при добавяне на вещество, съдържащо антиоксидант. За да направим това, изчислихме S0 за системата без антиоксидант и извадихме от нея площта SS, която характеризира системата, към която е добавен антиоксидантът. Стойността на AS зависи от чувствителността на хемилуминометъра и условията на измерване. Съотношението AS/C ■ V (където С е концентрацията на изследвания биологичен материал в кюветата, g/l, а V е обемът на кюветата, l) изразява антиоксидантния капацитет на 1 g от изследвания материал, т.е. , растителен материал.

Антиоксидантният капацитет ASa на разтвор на стандартен антиоксидант, например кверцетин, поставен в същия обем на реакционната смес, се изчислява по подобен начин. Съотношението AS/CÄ ■ V (където CA е тегловната концентрация на антиоксиданта в кюветата, g/l) изразява антиоксидантния капацитет на 1 g от антиоксиданта.

За всеки от стандартните антиоксиданти беше записан сигнал от разтвори с няколко концентрации, за да се гарантира, че изчисленията се извършват в границите на линейна зависимост и получените резултати са възпроизводими. Наистина се получава линейна зависимост (ASa = kA ■ CA) на сигнала от концентрацията, от която се изчислява стехиометричният коефициент kA. Съгласно критерия на Fisher стойностите на kA, получени за стандартни антиоксиданти, са статистически значими с вероятност от 0,975. След това сигналът от четири концентрации беше записан за всяка от четирите растителни проби и за всички проби беше получена линейна зависимост на сигнала от концентрацията (AS = k ■ C), от която беше изчислен стехиометричният коефициент k. С вероятност от 0,975 (тест на Фишер), стойностите на k, получени за растителни проби, са статистически значими. Общият антиоксидантен капацитет на растителния материал по отношение на теглото на стандартния антиоксидант (mg%) се намира по формулата

OAU = k ■ 105. k

Стойностите бяха представени като средно аритметично ± стандартно отклонение (M ± 5) при p<0,05.

РЕЗУЛТАТИ ОТ ИЗСЛЕДВАНЕТО

Изследването на кинетиката на хемилуминесценцията в присъствието на натриев аскорбат (фиг. 1) показа, че този антиоксидант се характеризира с латентен период, когато CL е почти напълно потиснат. Продължителността му е пропорционална на количеството антиоксидант в системата. В този случай нито наклонът на кривите на CL, нито интензитетът на CL върху платото се променят. Това се обяснява с факта, че аскорбиновата киселина е силен антиоксидант, който прихваща всички радикали, образувани в системата, включително луминоловите радикали, и CL не се развива, докато целият аскорбат не се окисли.

Действието на токоферола (фиг. 2) се проявява чрез намаляване на интензивността на CL на плато, което е типично за слабите антиоксиданти, въпреки че токоферолът се счита за един от най-активните.

мощни антиоксиданти. Може би това несъответствие се дължи на факта, че в нашия експеримент свободните радикали са били във воден разтвор, докато ефектът на токоферола обикновено се изследва в неполярна среда. В работата, където комплексът на цитохром с с кардиолипин служи като източник на радикали и реакцията с луминол протича в този комплекс, токоферолът има свойствата на антиоксидант със средна сила.

След изследване на ефекта на различни концентрации на кверцетин върху нашата система (фиг. 3) и сравняване на кинетичните криви за него и натриев аскорбат и токоферол, може да се отбележи, че основният ефект на кверцетин се проявява в промяна на наклона на скоростта на развитие на CL, което е типично за умерените антиоксиданти.

Кривите на CL за всички изследвани отвари (фиг. 4) наподобяват кривите за кверцетин с леко намаляване на интензитета на CL в края, т.е.

Време, мин

Ориз. 1. Ефект на натриевия аскорбат върху кинетиката на хемилуминесценцията

Концентрациите на компонентите на системата: луминол - 40 μM, пероксидаза от хрян - 4 nM, водороден пероксид - 100 μM. Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,05 цМ; 3 - 0,10 цМ; 4 - 0,15 цМ; 5 - 0,2 цМ; 6 - 0,25 μM натриев аскорбат.

плато. Както е показано в работата, това поведение е типично за антиоксиданти със средна сила, които в нашия случай включват полифеноли - флавоноиди и танини. За инфузия на малинови плодове (фиг. 4, D) се забелязва намаляване на хемилуминесценцията на ниво плато, което е типично за слабите антиоксиданти, което в този случай е токоферол. По отношение на кверцетин и токоферол, запарката от плодове на малина съдържа 4,7 ± 0,9 µmol/g кверцетин и 11,9 ± 0,8 µmol/g токоферол.

При сравняване на хемилуминесцентните криви, получени за различни концентрации на четирите изследвани водни екстракта от растителни материали, беше показано, че приносът на средни и слаби антиоксиданти към общия антиоксидантен капацитет на пробите намалява в следния ред: инфузия на малинови плодове (фиг. 4, D), отвара от плодове на шипка (фиг. 4, C), отвара от плодове на офика (фиг. 4, A), отвара от плодове на глог (фиг. 4, B). Стойностите на AS по отношение на концентрацията C на изследваното вещество в кюветата и стойностите на общия антиоксидантен капацитет по отношение на кверцетин са показани в таблицата.

ОБСЪЖДАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Получените по време на експериментите данни и изчислените въз основа на тях стойности на TAU на изследваните обекти бяха сравнени със съдържанието на основните антиоксиданти в тях, определено с помощта на химични методи за анализ. Въпреки факта, че положителната корелация между общото количество антиоксиданти и TAU в различни обекти е неоспорима, има забележими разлики между тези показатели. Например, ако вземем сумата от съдържанието на флавоноиди, танини и аскорбинова киселина, тогава тя се оказва повече от изчислената TAU за всички изследвани обекти, с изключение на отвара от плодовете на глог (таблица).

Други изследователи също са показали, че резултатите от химичния анализ и стойността на TAU, определена чрез хемилуминесцентния метод, често не съвпадат. В работата се определя общият антиоксидантен капацитет

46 Време, мин

Аз" "ч чи----.

Ориз. 2. Ефект на токоферол върху кинетиката на хемилуминесценцията

Концентрациите на компонентите на системата: луминол - 40 μM, пероксидаза от хрян - 4 nM, водороден пероксид - 100 μM. Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,01 цМ; 3 - 0,025 цМ; 4 - 0,06 цМ; 5 - 0,1 цМ; 6 - 0,2 μM токоферол.

46 Време, мин

Ориз. Фиг. 3. Ефект на кверцетин върху кинетиката на хемилуминесценцията. Концентрации на системните компоненти: луминол - 40 μM, пероксидаза от хрян - 4 nM, водороден пероксид - 100 μM. Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,02 цМ; 3 - 0,03 цМ; 4 - 0,04 цМ; 5 - 0,05 цМ; 6 - 0,06 μM кверцетин.

Време, мин

46 Време, мин

120 I 100 80 \ 60 40 20

46 Време, мин

Ориз. Фиг. 4. Влияние на отвари от плодове на офика (A), глог (B), дива роза (C) и инфузия на малинови плодове (D) върху кинетиката на хемилуминесценцията. (А) Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g/l отвара от плодове на офика. (B) Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l отвара от плодовете на глог. (C) Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l отвара от шипки. (D) Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l запарка от малини.

в системата пероксидаза-луминол-водороден пероксид корелира със съдържанието на тритерпенови съединения. Но в работата на същите автори, в която друго растение е обект на изследване, не се наблюдава връзка между TAU и съдържанието на която и да е група вещества, включително флавоноиди.

Тези несъответствия са свързани с поне три фактора. Първо, важна е активността на антиоксидантите, т.е. скоростта на тяхното взаимодействие с радикалите, която е различна за различните антиоксиданти, съставляващи растителната проба. Според Измайлов скоростните константи на съответните реакции за мексидол, токоферол и кверцетин са съотношени като 0,04:2:60. Второ, всяка антиоксидантна молекула, влизайки в химическа реакция, може да прихване различен брой радикали. Според работата, кверцетинът, пикочната и аскорбиновата киселина са прихванали съответно 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 и 0,5 ± 0,2 радикала на реагирала антиоксидантна молекула (използвана е система gemin-H202-luminol). Трето, резултатите от изследването могат да бъдат повлияни от наличието на пероксидазна активност в самите растителни проби, както в работата, както и от наличието на калций в пробите, което, както е показано в работата, е в състояние да увеличи активността на пероксидазата от хрян при определени условия. Това обикновено води до повече

по-висок интензитет на CL на платото, отколкото на контролните криви, което обаче не наблюдавахме.

Първият фактор рязко ограничава използването на такъв параметър като промяна в светлинната сума, тъй като времето за измерване на хемилуминесценцията трябва да бъде по-дълго от времето на консумация на всички антиоксиданти в тестовата проба. Наближаването на този момент може да се прецени само чрез измерване на кинетиката на хемилуминесценцията. В допълнение, приносът на слабите антиоксиданти към OAE е рязко подценен, тъй като времето на пълното им окисление е многократно по-дълго от допустимото време за измерване (10–20 минути).

От още по-голямо значение е стехиометричният коефициент на антиоксиданта. Броят на прихванатите от тях радикали n е равен на

където p е стехиометричният коефициент, а Am е промяната в концентрацията на антиоксидант по време на измерването, в нашия случай първоначалната концентрация на тестваното вещество в тестовата проба.

Разликата в светлинната сума на луминесценцията в отсъствието на антиоксидант и в негово присъствие е пропорционална на n.Общият брой на прихванатите радикали е n = Y.p. м,

където е стехиометричният коефициент на даден антиоксидант, а m е концентрацията му по време на промяната

Обект на изследване Флавоноиди, mg%* Танини, mg%* Аскорбинова киселина, mg%* AS/C ■ 10-8, произв. единици OAU, mg% кверцетин

Отвара от плодове на офика 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Отвара от шипки 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Отвара от плодове на глог 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Запарка от сушени малини 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Забележка: * - литературни данни, . AS - изменение на светлосумата за пробата, отн. единици, С - концентрация на пробата в кюветата, g/l. Изчислените стойности са надеждни на стр<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

рений. Общият брой на прихванатите радикали очевидно не е равен на общото количество антиоксиданти, тъй като коефициентите pt не само не са равни на единица, но и се различават значително за различните антиоксиданти.

Стойността на n е пропорционална на разликата в светлинните суми, измерени за определено време между проба, съдържаща антиоксидант, и контролна проба, несъдържаща антиоксиданти:

където k е коефициент, който е постоянен при едни и същи условия на измерване.

Методът, разгледан в статията, позволява определяне на общия антиоксидантен капацитет, докато химическият анализ позволява определяне на общото съдържание на антиоксиданти в продукта. Следователно хемилуминесцентният метод изглежда по-информативен от химичните анализи.

Условията, които сме избрали за оценка на общия антиоксидантен капацитет на растителните суровини чрез записване на кинетиката на хемилуминесценцията в система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден пероксид и луминол (концентрациите на компонентите са съответно 4 nM, 100 μM и 40 μM; 20 mM фосфатен буфер, pH 7,4),

осигурява окисление на силни антиоксиданти (аскорбинова киселина) и умерени антиоксиданти (кверцетин) за 10 минути. Тази продължителност на измерване е удобна и осигурява необходимото качество на измерванията.

Анализът на кинетиката на хемилуминесценцията показа, че в изследваните обекти (отвари от офика, дива роза, плодове на глог и инфузия на плодове от малина) основните антиоксиданти са средни антиоксиданти, включително флавоноиди, и антиоксиданти със слаба сила (токоферол и др. ). Въз основа на намаляването на хемилуминесцентната светлинна сума е изчислен общият антиоксидантен капацитет за изследваните обекти. Сравнението на получените стойности на TAU с резултатите от химичния анализ показа, че продуктите, съдържащи едно и също количество антиоксиданти с различни съотношения, могат да се различават по способността си ефективно да защитават тялото от вредното въздействие на свободните радикали. Описаната техника е обещаваща за изследване на растителни обекти, съдържащи смес от различни антиоксиданти. В същото време се характеризира с простота и ниска цена на изследването. Комбинирането на измерването на кинетиката на хемилуминесценцията с математическото моделиране на реакциите ще позволи не само да се автоматизира процеса на определяне на TAU, но и да се определи приносът на отделните групи антиоксиданти към индикатора.

Литература

1. Проскурнина Е. В., Владимиров Ю. А. Свободните радикали като участници в регулаторни и патологични процеси. В: Григориев А. И., Владимиров Ю. А., редактори. Фундаментални науки - медицина. Biophys. пчелен мед. технолог. Москва: МАКС Прес; 2015 г. том 1. стр. 38-71.

3. Хасанов В. В., Рижова Г. Л., Малцева Е. В. Методи за изследване на антиоксиданти. Chem. раст. сурови материали. 2004 г.; (3): 63-75.

4. Василиев Р. Ф., Кънчева В. Д., Федорова Г. Ф., Батовска Д. И., Трофимов А. В. Антиоксидантна активност на халконите. Хемилуминесцентно определяне на реактивността и квантово-химично изчисляване на енергиите и структурите на реагентите и междинните съединения. Кинетика и катализа. 2010 г.; 51(4): 533-41.

6. Федорова Г.Ф., Трофимов А.В., Василев Р.Ф., Вепринцев Т.Л. Перокси-

радикално медиирана хемилуминесценция: механично разнообразие и основи за антиоксидантен анализ. Arkivoc. 2007 г.; 8:163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Оценка на антирадикален капацитет чрез H2O2-хемин-индуцирана хемилуминесценция на луминол. J Agric Food Chem. 3 декември 2003 г.; 51 (25): 7481-8.

9. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В. Свободни радикали и клетъчна хемилуминесценция. Успехи биол. хим. 2009 г.; 49:341-88.

10. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В., Измайлов Д. Ю. Кинетичната хемилуминесценция като метод за изследване на свободните радикални реакции. Биофизика. 2011 г.; 56(6): 1081-90.

11. Измайлов Д. Ю., Демин Е. М., Владимиров Ю. А. Определяне на антиоксидантна активност чрез измерване на кинетиката на хемилуминесценцията. Фотобиология и фотомедицина. 2011 г.; 7(2):70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Луминолова луминесценция, индуцирана от 2,2"-азо-бис(2-амидинопропан) термолиза. Безплатно

Radic Res Commun. 1992 г.; 17(5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Относно използването на охлаждането на луминесценцията на луминол за оценка на активността на SOD. Free Radic Biol Med. юни 1994 г.; 16(6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Оценка на общия антиоксидантен потенциал (TRAP) и общата антиоксидантна реактивност от усилени с луминол хемилуминесцентни измервания. Free Radic Biol Med. февруари 1995 г.; 18(2):153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Изследване на механизма на луминисцентна пероксидация на луминол чрез техники на спрян поток. J Biol Chem. 1968 25 септември; 243(18): 4706-14.

21. Алексеев А. В., Проскурнина Е. В., Владимиров Ю. А. Определяне на антиоксиданти чрез активирана хемилуминесценция с помощта на 2,2'-азо-бис (2-амидинопропан). Бюлетин на Московския държавен университет. Серия 2. Хим. 2012; 53 ( 3): 187-93.

24. Министерството на здравеопазването на СССР Държавна фармакопея на СССР XI изд. Проблем. 2 „Общи методи за анализ. Лечебни растителни суровини". М.: Медицина; 1987. p. 147-8.

25. Сергунова Е. В., Сорокина А. А., Корнюшина М. А. Изследване на препарати от екстракт от шипка. Аптека. 2012 г.; (2): 14-6.

26. Сергунова Е. В., Сорокина А. А., Аврач А. С. Изследване на плодовете на глог при различни начини за консервиране и извличане на вода. Аптека. 2010 г.; (5): 16-8.

27. Аврач А. С., Сергунова Е. В., Куксова Я. В. Биологично активни вещества от плодове и водни екстракти от обикновена малина. Аптека. 2014 г.; (1): 8-10.

28. Аврах А. С., Самилина И. А., Сергунова Е. В. Изследване на биологично активни вещества от плодове на глог - суровини за приготвяне на хомеопатични матрични тинктури. В сб. научен тр. По материали от XXIV моск. междун. хомеопат. конф. „Развитие на хомеопатичния метод в съвременната медицина”; 24-25 януари 2014 г.; Москва. М.; 2014. стр. 146-7.

29. Сергунова Е. В., Сорокина А. А. Изследване на състава на биологично активни вещества в лекарствени растителни суровини с различни методи за съхранение. В сб. резюмета, базирани на XX Ross. нац. конгр. „Човекът и лекарството”; 15-19 април 2013 г.; Москва. Москва: ЕкоОнис; 2013. стр. 184-90.

30. Александрова Е. Ю., Орлова М. А., Нейман П. Л. Изследване на активността на пероксидазата в екстракти от коренища и корени на хрян и неговата устойчивост на различни влияния. Вестн. Московски държавен университет. сер. 2. Chem. 2006 г.; 47(5):350-2.

1. Проскурнина Е. В., Владимиров ЮА. Free radikaly kak uchastniki regulyatornykh i patologicheskikh protsessov. В: Григор "ев AI, Владимиров ЮА, редактори. Фундаментални" nye nauki - meditsine. Биофизически медицински технологии. Москва: МАКС Прес; 2015.v. 1. стр. 38-71. Руски.

2. Chanda S, Dave R. In vitro модели за оценка на антиоксидантната активност и някои лечебни растения, притежаващи антиоксидантни свойства: Общ преглед. Afr J Microbiol Res. декември 2009 г.; 3(13): 981-96.

3. Khasanov VV, Ryzhova GL, Mal "tseva EV. Metody issledovaniya antioksidantov. Химия Раститель "ного Сир" ja. 2004; (3): 63-75. Руски.

4. Васил "ев RF, K" "ncheva VD, Fedorova GF, B" "tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" khalkonov. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reaktsionnoi sposobnosti и kvantovo-khimicheskii raschet energii i stroeniya reagentov i intermediatov. Кинетика и катализа. 2010 г.; 51(4): 533-41. Руски.

5. Славова-Казакова А. К., Ангелова С. Е., Вепринцев Т. Л., Денев П., Фабри Д., Детори М. А. и др. Антиоксидантен потенциал на съединения, свързани с куркумин, изследван чрез кинетика на хемилуминесценция, ефективност на прекъсване на веригата, активност на почистване (ORAC) и DFT изчисления. Beilstein J Org Chem. 2015 11 август; 11:1398-411.

6. Федорова Г. Ф., Трофимов А. В., Василев Р. Ф., Вепринцев Т. Л. Хемилуминесценция, медиирана от перокси-радикали: механично разнообразие и основи за антиоксидантен анализ. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

7. Федорова Г. Ф., Меншов В. А., Трофимов А. В., Васильев Р. Ф. Лесен хемилуминесцентен анализ за антиоксидантни свойства на растителни липиди: основи и илюстративни примери. Анализатор, 2009 г. Октомври; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Оценка на антирадикален капацитет чрез H2O2-хемин-индуциран луминол

9. Владимиров ЮА, Проскурнина Е.В. Безплатна радикална и клетъчна хемилюминесценция. Usp Biol Khim. 2009 г.; 49:341-88. Руски.

10. Владимиров ЮА, Проскурнина ЕВ, Измайлов ДЮ. Kineticheskaya hemilyuminestsentsiya като метод на изследване на реакциите на свободните радикали. биофизика. 2011 г.; 56(6): 1081-90. Руски.

11. Измайлов ДЮ, Демин Е.М., Владимиров ЮА. Opredelenie aktivnosti antioksidantov metodom izmereniya kinetiki hemilyuminestsen-tsii. Фотобиология и фотомедицина. 2011 г.; 7(2):70-6. Руски.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Луминолова луминесценция, индуцирана от 2.2"-Азо-бис(2-амидинопропан) термолиза. Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Видима хемилуминесценция, свързана с реакцията между метхемоглобин или оксихемоглобин с водороден пероксид. Photochem Photobiol. ноември 1994 г.; 60(5):405-11.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV, et al. In vitro оценка на антиоксидантната активност на липозомните флавоноли чрез системата HRP-H2O2-luminol. J Microencapsul. 2011 г.; 28(4):258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Изследване на механизма

на луминисцентната пероксидация на луминол чрез техники на спрян поток. J Biol Chem. 1968 25 септември; 243(18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Фитохимични характеристики, дейности за отстраняване на свободните радикали и неврозащита на пет екстракта от лечебни растения. Базирано на доказателства допълнение Alternat Med. 2012 г.; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 2011, 10 август.

19. Chang CL, Lin CS. Фитохимичен състав, антиоксидантна активност и невропротективен ефект на екстракти от Terminalia chebula Retzius. Базирано на доказателства допълнение Alternat Med. 2012 г.; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011, 5 юли.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Оценка на антиоксидантната активност на различни флавоноиди по метода на хемилуминесценцията. AAPS PharmSci. 2003 г.; 5(2):111-5.

21. Алексеев AV, Проскурнина EV, Владимиров ЮА. Opredelenie antioksidantov metodom aktivirovannoi hemilyuminestsentsii s ispol "zovaniem 2.2" -azo-bis (2-amidinopropana). Химически бюлетин на Московския университет. 2012 г.; 53 (3): 187-93. Руски.

22. Pogacnik L, Ulrih NP. Приложение на оптимизиран хемилуминесцентен анализ за определяне на антиоксидантния капацитет на билкови екстракти. Луминесценция. 2012 ноември-декември; 27(6):505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Общи антиоксиданти с ниско молекулно тегло като обобщен параметър, количествено определени в биологични проби чрез анализ за инхибиране на хемилуминесценцията. Nat протокол. 2010 септември; 5(10): 1627-34.

24. Министерство на здравеопазването на СССР. Государсвенная фармакопея на СССР. 11-то изд. бр. 2. „Общи методи на анализ.

Лекарственное растение "ное сыр" е", Москва: Медлцина, 1987, стр. 147-8. Руски.

25. Сергунова Е.В., Сорокина А.А., Корнюшина М.А. Изучение екстрактионных препаратов шиповника. Аптека. 2012 г.; (2): 14-6. Руски.

26. Сергунова EV, Сорокина AA, Avrach AS. Izuchenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposobov konzervatsii i vodnykh izvlechenii. Фармация. 2010 г.; (5): 16-8. Руски.

27. Аврач А.С., Сергунова Е.В., Куксова Я.В. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov и vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Фармация. 2014 г.; (1): 8-10. Руски.

28. Аврач AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - syr "ya dlya pripravleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Доклади на 14-та Московска международна хомеопатична конференция "Razvitie gomeopaticheskogo metoda v sovremennoi meditsine"; 2014 Jan 24-25; Москва. М.; 7. Руски.

29. Сергунова Е.В., Сорокина А.А. Izuchenie sostava biologicheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom sir" e razlichnykh sposobov konzervatsii. Сборник на 20-ия Руски национален конгрес "Человек и лекарство"; 2013 април 1519 г.; Москва. Москва: ЕкООнис; 2013. стр. 184-90. Руски.

30. Александрова EYu, Орлова MA, Neiman PL. Izuchenie peroksidaznoi aktivnosti v ekstraktakh iz kornevishcha и kornei khrena i ee stabil "nosti k razlichnym vozdeistviyam. Бюлетин по химия на Московския университет. 2006; 47 (5): 350-2. Руски.

], но дефинирането на антиоксидантите като химични съединения не дава пълна картина на защитните свойства на обекта, който се изследва: те се определят не само от количеството на един или друг антиоксидант, но и от активността на всеки от тях . Антиоксидантната активност или антиоксидантната активност, AOA, е константата на скоростта на реакцията на антиоксидант със свободен радикал (kInH). Методът на хемилуминесценцията (CL) позволява да се определи общото количество радикали, които антиоксидантите свързват в пробата (общ антиоксидантен капацитет, TAU), а когато се използва методът на математическото моделиране на кинетиката на CL, също и скоростта на образуване и реакция на радикали с антиоксиданти, т.е. AOA [ , , ].

Най-честата модификация на хемилуминесцентния метод за определяне на общия антиоксидантен капацитет се основава на използването на луминол като хемилуминесцентен активатор [ , , , ]. В кюветата на хемилуминометъра се поставя проба с добавяне на луминол, водороден пероксид и съединение, способно да генерира радикали в резултат на спонтанно разлагане (термолиза), например 2,2'-азобис-(2-амидинопропан) дихидрохлорид (ABAP): ABAP → 2R. В присъствието на молекулярен кислород алкиловият радикал R образува пероксилен радикал ROO : R + O 2 → ROO . Освен това пероксилният радикал окислява хемилуминесцентната проба луминол (LH 2) и се образува луминолният радикал (LH ): ROO + LH 2 → ROOH + LH . От LH, чрез образуването на междинни съединения (луминол хидропероксид и луминол ендопероксид), се образува молекула на крайния продукт на окисление на луминол, аминофталова киселина, в електронно възбудено състояние, което излъчва фотон и в резултат на това се наблюдава хемилуминесценция . Интензитетът на CL е пропорционален на скоростта на производство на фотони, която от своя страна е пропорционална на стационарната концентрация на LH в системата. Взаимодействайки с радикалите, антиоксидантите прекъсват описаната верига от трансформации и предотвратяват образуването на фотон.

Съединенията, подложени на термолиза, не са единственият възможен източник на радикали при анализа на антиоксидантния капацитет на пробата по хемилуминесцентния метод. Алтернативи са системите пероксидаза от хрян–водороден прекис [ , ], хемин–водороден прекис, цитохром с–кардиолипин–водороден пероксид и др. Схемата на реакциите на окисление на луминол от пероксидази е разгледана в работата на Cormier et al. .

Кинетичните криви на CL за тези системи отразяват два етапа на реакцията: етап на увеличаване на интензитета на CL и етап на плато или постепенно намаляване на луминесценцията, когато интензитетът на CL е или постоянен, или бавно намалява. Документът описва два подхода за измерване на общия антиоксидантен капацитет, които вземат предвид тази характеристика на кривите. Методът TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) се основава на измерването на латентния период на CL τ и могат да се използват за определяне на антиоксиданти като тролокс или аскорбинова киселина: те се характеризират с висока стойност на константата на скоростта на реакция с радикали и поради тази причина могат да бъдат наречени силни антиоксиданти. През латентния период настъпва пълното им окисление. Методът TAR (обща антиоксидантна реактивност) измерва степента на потушаване на хемилуминесценцията рв платото или в максимума на хемилуминесцентната крива: формула , където I е интензитетът на хемилуминесценцията без антиоксидант, а I 1 е интензитетът на CL в присъствието на антиоксидант. Този метод се използва, ако системата съдържа предимно слаби антиоксиданти с ниски скоростни константи на взаимодействие с радикалите - много по-ниски в сравнение с луминоловата константа.

Действието на антиоксидантите се характеризира не само с показатели τ и р. Както може да се види от [ , ], ефектът на такива антиоксиданти като пикочна киселина в системата хемин-H2O2-луминол или токоферол, рутин и кверцетин в цитохрома с–кардиолипин–H 2 O 2 –луминол, характеризиращ се с промяна в максималната скорост на нарастване на CL ( vmax). Както показват резултатите от математическото моделиране на кинетиката, стойностите на константите на скоростта на взаимодействие на тези антиоксиданти с радикали са близки до стойността на луминолната константа, следователно такива антиоксиданти могат да се нарекат антиоксиданти със средна сила.

Ако изследваният материал, по-специално растителните суровини, съдържаше само един вид антиоксиданти, тогава тяхното съдържание може да се характеризира с един от трите показателя, изброени по-горе ( τ , рили vmax). Но растителните суровини съдържат смес от антиоксиданти с различна сила. За да решат този проблем, някои автори [ , , , ] използваха промяната в светлинната сума на хемилуминесценцията за определено време ∆S, изчислена по формулата , където ∆ S0и ∆ S S- CL светлинни суми за дадено време Tсъответно в контролните и опитните проби. Времето трябва да е достатъчно за окисляването на всички антиоксиданти в системата, т.е. CL кривата на тестовата проба да достигне нивото на CL кривата на контролната проба. Последното предполага, че изследователите трябва не само да записват светлинната сума на луминесценцията, но и да записват кривата на кинетиката на CL за достатъчно дълго време, което не винаги се прави.

Тъй като всички измерени показатели зависят от устройството и условията на измерване, антиоксидантният ефект на дадено вещество в изследваната система обикновено се сравнява с ефекта на антиоксидант, взет като стандарт, например Trolox [ , ].

Системата пероксидаза от хрян – водороден пероксид е използвана за анализиране на общия антиоксидантен капацитет на растителните материали от много автори. В работи [ , ] латентният период на CL (TRAP метод) е използван за оценка на количеството антиоксиданти в пробите, а в работи [ , , ] е използвана площта под кривата на развитие на CL. Изброените работи обаче не дават ясна обосновка за избора на един или друг параметър за оценка на TAU.

Целта на изследването беше да се определи как съотношението на антиоксиданти от различни видове влияе на TAU и да се модифицира хемилуминесцентният метод по такъв начин, че да може по-точно да се определи TAU в растителни материали. За целта сме си поставили няколко задачи. Първо, да се сравни кинетиката на CL на изследваните обекти с кинетиката на стандартни антиоксиданти от три вида (силен, среден и слаб), за да се разбере кой тип антиоксиданти имат основен принос за TAE на изследваните обекти. Второ, да се изчисли RAE на изследваните обекти чрез измерване на намаляването на светлинната сума на CL под действието на тези обекти в сравнение с действието на антиоксиданта, който осигурява най-голям принос към TAC.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Обект на изследването бяха промишлени проби от плодове на глог, планински ясен и шипки, произведени от Krasnogorskleksredstva JSC (Русия), както и малинови плодове, събрани от авторите в Московска област в условия на естествен растеж и изсушени при температура от 60–80 ° C, докато спрат да изолират деформации от сок и налягане.

Реагентите за анализ на антиоксидантния капацитет по хемилуминесцентния метод са: KH2PO4, 20 mM буферен разтвор (pH 7.4); пероксидаза от корени на хрян (активност 112 U/mg, М = 44 173.9), 1 mM воден разтвор; луминол (5-амино-1,2,3,4-тетрахидро-1,4-фталазиндион, хидразид на 3-аминофталова киселина, М=177.11), 1 mM воден разтвор; водороден пероксид (Н202, М = 34.01), 1 mM воден разтвор; разтвори на антиоксиданти (аскорбинова киселина, кверцетин, токоферол). Всички реагенти са произведени от Sigma Aldrich (САЩ).

Общият антиоксидантен капацитет се определя чрез регистриране на хемилуминесценция на хемилуминометър Lum-100 (DISoft, Русия) с помощта на софтуер PowerGraph 3.3. За определяне на TAU в растителни суровини, 40 µl луминол в концентрация 1 mM, 40 µl пероксидаза от хрян в концентрация 0,1 µM, от 10 до 50 µl отвара или инфузия (в зависимост от концентрацията) и фосфатен буфер в количеството, необходимо за достигане на общия обем на пробата до 1 ml. Кюветата беше инсталирана в устройството и CL беше записан, като се наблюдава фоновият сигнал. След 48 s регистрация на фоновия сигнал, към кюветата се добавят 100 µl H2O2 при концентрация 1 mM и CL регистрацията продължава 10 минути. Приготвени са четири проби с различна концентрация на всеки от растителните обекти. CL също беше записан за разтвори на аскорбинова киселина, кверцетин и токоферол при пет различни концентрации за всеки от антиоксидантите. Впоследствие TAU на пробите от отвари и настойки беше преизчислено за кверцетин.

Концентрациите на луминол, пероксидаза от хрян и водороден пероксид са избрани така, че да се определи антиоксидантният капацитет на водни екстракти от лечебни растителни материали за разумно време (не повече от 10 минути). През това време кривите на хемилуминесценцията на антиоксидантите аскорбат и флавоноида кверцетин (основните антиоксиданти на растителните материали) достигат плато, което показва пълното унищожаване на антиоксидантите в системата. Разрежданията на изследваните проби и концентрациите на разтвори на стандартни антиоксиданти (посочени в надписите към фигурите) са избрани така, че всички CL кинетични криви да бъдат измерени при една и съща чувствителност на инструмента.

Антиоксидантният капацитет се изчислява от промяната на площта (∆ С) под кинетичната крива на хемилуминесценция (светлинна сума) с добавяне на вещество, съдържащо антиоксидант. За това разчитахме S0за системата без антиоксидант и извади от нея площта S Sхарактеризиращи системата, към която е добавен антиоксидантът. ∆ стойност Сзависи от чувствителността на хемилуминометъра и условията на измерване. Съотношение ∆ S/C V(където ° С- концентрация на изследвания биологичен материал в кюветата, g/l, и V- обем на кюветата, l) изразява антиоксидантния капацитет на 1 g от изследвания материал, т.е. растителни материали.

Антиоксидантният капацитет ∆ S Aразтвор на стандартен антиоксидант, като кверцетин, поставен в същия обем на реакционната смес. Съотношение ∆ S A / C A V(където C A- тегловна концентрация на антиоксиданта в кюветата, g/l) изразява антиоксидантния капацитет на 1 g антиоксидант.

За всеки от стандартните антиоксиданти беше записан сигнал от разтвори с няколко концентрации, за да се гарантира, че изчисленията се извършват в границите на линейна зависимост и получените резултати са възпроизводими. Наистина се получава линейна зависимост (∆ S A = k A C A) сигнал от концентрацията, от която е изчислен стехиометричният коефициент kA. Съгласно критерия на Фишер, получените стойности за стандартни антиоксиданти kAстатистически значими с вероятност 0,975. След това сигналът от четири концентрации се записва за всяка от четирите растителни проби и за всички проби се наблюдава линейна зависимост на сигнала от концентрацията (∆ С = k C), който беше използван за изчисляване на стехиометричния коефициент к. С вероятност от 0,975 (тест на Фишер), стойностите на k, получени за растителни проби, са статистически значими. Общият антиоксидантен капацитет на растителния материал по отношение на теглото на стандартния антиоксидант (mg%) се намира с помощта на формулата.

Стойностите бяха представени като средно аритметично ± стандартно отклонение (M ± δ) при p

РЕЗУЛТАТИ ОТ ИЗСЛЕДВАНЕТО

Изследване на кинетиката на хемилуминесценцията в присъствието на натриев аскорбат (фиг. 1. Влияние на натриевия аскорбат върху кинетиката на хемилуминесценцията" data-note="Концентрации на компонентите на системата: луминол - 40 µM, пероксидаза от хрян - 4 nM, водороден пероксид - 100 µM. Криви: 1 - контролна проба; 2 - 0.05 µM; 3 - 0.10 µM; 4 - 0.15 µM; 5 - 0.2 µM; 6 - 0.25 µM натриев аскорбат. антиоксидантът се характеризира с латентен период, когато CL е почти напълно потиснат. Продължителността му е пропорционална на количеството антиоксидант в системата.В същото време нито наклонът на CL кривите, нито интензитетът на CL върху платото се променят.Това се дължи на факта, че аскорбиновата киселина е силен антиоксидант, който прихваща всички радикали. образувани в системата, включително луминолови радикали, и CL не се развива, докато целият аскорбат не се окисли.

Други изследователи също са показали, че резултатите от химичния анализ и стойността на TAU, определена чрез хемилуминесцентния метод, често не съвпадат. В работата общият антиоксидантен капацитет, определен в системата пероксидаза-луминол-водороден пероксид, корелира със съдържанието на тритерпенови съединения. Но в работата на същите автори, в която друго растение е обект на изследване, не се наблюдава връзка между TAU и съдържанието на която и да е група вещества, включително флавоноиди.

Тези несъответствия са свързани с поне три фактора. Първо, важна е активността на антиоксидантите, т.е. скоростта на тяхното взаимодействие с радикалите, която е различна за различните антиоксиданти, съставляващи растителната проба. Според Измайлов скоростните константи на съответните реакции за мексидол, токоферол и кверцетин са съотношени като 0,04:2:60. Второ, всяка антиоксидантна молекула, влизайки в химическа реакция, може да прихване различен брой радикали. Според работата, кверцетинът, пикочната и аскорбиновата киселина са прихванали съответно 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 и 0,5 ± 0,2 радикала на реагирала антиоксидантна молекула (използвана е системата хемин-H 2 O 2 – луминол). Трето, резултатите от изследването могат да бъдат повлияни от наличието на пероксидазна активност в самите растителни проби, както в работата, както и от наличието на калций в пробите, което, както е показано в работата, е в състояние да увеличи активността на пероксидазата от хрян при определени условия. Това обикновено причинява по-висок интензитет на CL на платото, отколкото на контролните криви, което обаче не наблюдавахме.

От още по-голямо значение е стехиометричният коефициент на антиоксиданта. Броят на радикалите н, пресечено от него, е равно на , където ρ - стехиометричен коефициент и ∆ м- промяна в концентрацията на антиоксиданта по време на измерването, в нашия случай - първоначалната концентрация на тестваното вещество в пробата.

Разликата в светлинната сума на сиянието при липса на антиоксидант и при негово присъствие е пропорционална на н. Общият брой на прихванатите радикали е , където ρiе стехиометричният коефициент на конкретен антиоксидант, и m i- концентрацията му по време на измерването. Общият брой на прихванатите радикали очевидно не е равен на общото количество антиоксиданти, тъй като коефициентите ρiне само не са равни на единица, но и се различават значително за различните антиоксиданти.

Стойност не пропорционална на разликата в светлинните суми, измерени за определено време между проба, съдържаща антиоксидант, и контролна проба, несъдържаща антиоксиданти: С = k n, където к- константа на коефициента при същите условия на измерване.

Условията, които избрахме за оценка на общия антиоксидантен капацитет на растителните суровини чрез записване на кинетиката на хемилуминесценцията в система, състояща се от пероксидаза от хрян, водороден пероксид и луминол (концентрации на компонентите - съответно 4 nM, 100 μM и 40 μM; 20 mM фосфатен буфер, рН 7,4), осигурява окисляването на силни антиоксиданти (аскорбинова киселина) и умерени антиоксиданти (кверцетин) за 10 минути. Тази продължителност на измерване е удобна и осигурява необходимото качество на измерванията.

Щраквайки върху бутона "Изтегляне на архив", вие ще изтеглите безплатно необходимия ви файл.
Преди да изтеглите този файл, запомнете онези добри есета, контролни, курсови работи, дипломни работи, статии и други документи, които не са заявени на вашия компютър. Това е ваша работа, тя трябва да участва в развитието на обществото и да носи полза на хората. Намерете тези произведения и ги изпратете в базата знания.
Ние и всички студенти, докторанти, млади учени, които използват базата от знания в обучението и работата си, ще ви бъдем много благодарни.

За да изтеглите архив с документ, въведете петцифрен номер в полето по-долу и щракнете върху бутона "Изтегляне на архив"

Подобни документи

Изследване на ензимни и неензимни пътища за образуване на реактивни кислородни видове. Механизми на тяхното увреждащо действие върху живите клетки, по-специално инициирането на липидна пероксидация на свободните радикали. Антиоксидантна защита на организма.

курсова работа, добавена на 11.01.2017 г

Антиоксидантна активност на растителни материали. Описание на растения с антиоксидантна активност. Определяне на съдържанието на витамин С в калина вулгарис през периода на зреене, съдържанието на полифенолни съединения в различни сортове чай.

дисертация, добавена на 04/02/2009

Гиберелините са обширен клас фитохормони, които регулират растежа и развитието: история на откриването, химична структура, класификация, съдържание в растенията. Биохимия, регулаторни функции и биологична активност на гиберелините, тяхната структура, свойства.

презентация, добавена на 20.10.2014 г

резюме, добавено на 19.05.2017 г

Биологична активност и химична структура на брасиностероидите. Синтези със запазване на въглеродния скелет. Формиране на функции, характерни за цикличната част на брасиностероидите. Изграждане на странична верига с образуването на нови въглерод-въглеродни връзки.

курсова работа, добавена на 12/07/2014

Изследване на физиологията на панкреаса, ролята на панкреатичния сок в процеса на храносмилане. Анализ на активните кислородни видове и начините на тяхното образуване, биохимия на свободнорадикалните процеси. Преглед на състоянието на метаболитните процеси при остър панкреатит.

курсова работа, добавена на 03/10/2012

Химичен състав на род Penstemon и биологична активност. Качествен фитохимичен анализ на растителни суровини чрез тънкослойна хроматография. Определяне на количествения състав на компонентите чрез високоефективна течна хроматография.

практическа работа, добавена на 07.01.2016 г

дипломна работа

1.4 Методи за изследване на антиоксиданти

антиоксидантната активност се класифицира: според методите за регистриране на проявената АОА (обемни, фотометрични, хемилуминесцентни, флуоресцентни, електрохимични); по вид източник на окисление; по вид на окисленото съединение; според метода за измерване на окисленото съединение.

Но най-известните методи за определяне на антиоксидантната активност са:

1 TEAC (еквивалентен на тролокс антиоксидантен капацитет): методът се основава на следната реакция:

Метмиоглобин + H 2 O 2 > Ферилглобин + ABTS > ABTS * + AO.

Методът за еквивалентност на Trolox (TEAC) се основава на способността на антиоксидантите да редуцират 2,2-азинобис радикалните катиони (ABTS) и по този начин да инхибират абсорбцията в дългата част на вълната на спектъра (600 nm). Съществен недостатък на метода е двуетапната реакция на получаване на радикал. Това удължава времето за анализ и може да увеличи разсейването на резултатите, въпреки факта, че за анализа се използва стандартизиран набор от реагенти.

2 FRAP (желязо-редуцираща антиоксидантна сила): методът се основава на следната реакция:

Fe(III)-трипиридилтриазин+AO>Fe(II)-трипиридилтриазин.

Желязо редуциращ/антиоксидантен капацитет (FRAP). Тук се използва реакцията на редукция на Fe(III)-трипиридилтриазин до Fe(II)-трипиридилтриазин. Този метод обаче не може да определи някои антиоксиданти, като например глутатиона. Този метод позволява директно определяне на антиоксиданти с ниско молекулно тегло. При ниско рН редукцията на Fe(III) трипиридилтриазин комплекс до Fe(II) комплекс е придружена от появата на интензивен син цвят. Измерванията се основават на способността на антиоксидантите да потискат окислителния ефект на реакционните частици, генерирани в реакционната смес. Този метод е прост, бърз и евтин при изпълнение.

3 ORAC (капацитет на абсорбция на кислородни радикали): методът се основава на следната реакция:

Fe (II) + H 2 O 2 > Fe (III) + OH * + AO> OH * + Луминол.

Определяне на способността за абсорбиране на кислородни радикали (ORAC). При този метод се записва флуоресценцията на субстрата (фикоеритрин или флуоресцеин), която възниква в резултат на взаимодействието му с ROS. Ако има антиоксиданти в тестовата проба, тогава се наблюдава намаляване на флуоресценцията в сравнение с контролната проба. Този метод първоначално е разработен от д-р Guohua Cao в Националния институт по стареене през 1992 г. През 1996 г. д-р Cao се присъединява към д-р Роналд Прайър в съвместна група в Изследователския център за стареене на USDA, където е разработен полуавтоматизиран метод. развити.

4 TRAP (антиоксидантен параметър за общо улавяне на радикали): методът се основава на следната реакция:

AAPH+AO>AAPH* + PL (PE).

Този метод използва способността на антиоксидантите да взаимодействат с пероксилния радикал 2,2-азобис(2-амидинопропан) дихидрохлорид (AAPH). Модификациите на TRAP се състоят в методи за регистриране на аналитичен сигнал. Най-често на последния етап от анализа перокси радикалът AAPH взаимодейства с луминесцентен (луминол), флуоресцентен (дихлорофлуоресцин диацетат, DCFH-DA) или друг оптически активен субстрат.

Водоразтворимото производно на витамин Е Trolox (6-хидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокси киселина) се използва като стандарт за методите TEAC, ORAC и TRAP.

Напоследък нараства интересът към използването на електрохимични методи за оценка на антиоксидантната активност. Тези методи са с висока чувствителност и бърз анализ.

Оценката на антиоксидантната активност на някои хранителни продукти се извършва чрез потенциометричен метод, основан на използването на свойството на антиоксидантните вещества да участват в окислително-редукционни реакции поради енолни (-OH) и сулфхидрилни (-SH) групи.

Определянето на антиоксидантните свойства на разтворите се основава на химичното взаимодействие на антиоксидантите с медиаторната система, което води до промяна в нейния редокс потенциал. Електрохимичната клетка е контейнер, съдържащ K-Na-фосфатен буферен разтвор, Fe(III)/Fe(II) медиаторна система и сложен електрод преди измерване на редокс потенциала. Антиоксидантната активност се оценява в g-eq/l.

Амперометричният метод за определяне на антиоксидантната активност се основава на измерване на електрическия ток, който възниква по време на окисляването на тестваното вещество върху повърхността на работния електрод, който е под определен потенциал. Чувствителността на амперометричния метод се определя както от естеството на работния електрод, така и от потенциала, приложен към него. Границата на откриване на амперометричния детектор на полифеноли, флавоноиди е на ниво нанопикограми, при такива ниски концентрации има по-малка вероятност от взаимно влияние на различни антиоксиданти в тяхното съвместно присъствие, по-специално проявата на феномена на синергизъм . Недостатъците на метода включват неговата специфичност: при тези условия не могат да бъдат анализирани антиоксиданти, които сами по себе си се окисляват или редуцират в областта на потенциалите за електроредукция на кислород. Предимствата на метода включват неговата бързина, простата и чувствителност.

Метод на галваностатична кулонометрия с използване на електрогенерирани оксиданти – методът е приложим за анализ на мастноразтворими антиоксиданти.

Разработени са различни методи за определяне на аскорбинова киселина:

амперометричен метод, използващ алуминиев електрод, модифициран с филм от никелов (II) хексацианоферат чрез прост метод на потапяне в разтвор;

метод за твърдофазно спектрофотометрично и визуално тестово определяне на аскорбинова киселина с използване на ксерогел от силициева киселина, модифициран с реагент на Wawel и мед (II) като индикаторен прах;

хемилуминесцентното определяне на аскорбинова киселина може да се извърши чрез метода на поточна инжекция съгласно хемилуминесцентната реакция на родамин В с церий (IV) в среда на сярна киселина.

определяне на аскорбинова киселина в границите 10 -8 -10 -3 g/cm 3 чрез анодна волтаметрия във водни и водно-органични среди.

Най-често срещаният е методът FRAP, тъй като е експресен, високочувствителен. През последните няколко десетилетия са разработени голям брой разновидности на методи за определяне на антиоксидантната активност по метода FRAP (таблица 1).

Таблица 1 Развитие на метода FRAP и приложението му за определяне на антиоксидантната активност на различни обекти

	Обекти на анализ	Бележки
	кръвна плазма	t=4мин. Изследвани са стехиометрията на реакцията и адитивността.
	Чай, вино	Определяне на AOA поради полифеноли
		Сравняват се стойностите на AOA на различни видове чай
Пулидо, Браво, Саура-Каликсто	Моделни решения	t=30мин. Разкрито е влиянието на неводния разтворител
	растения
	кръв, тъкан	PIA метод. Проверено е влиянието на чужди вещества.
Фирузи, Лакана, Петручи и др.	Моделни решения	Изследвана е чувствителността на определяне на различни АО като функция на тяхната структура и редокс потенциал.
Каталинич, Милош,	Различни вина
Темердашев, Цюпко и др.	Моделни смеси
Логинова, Коновалова	Лекарства. Препарати	метод на тестване
Темердашев, Цюпко и др.	Червени сухи вина	Корелация на AOA с други показатели за качество на виното
Таблица 1 продължава
	Моделни смеси	Чувствителността на определянето на различни АО
Вершинин, Власова, Цюпко	Моделни смеси	Разкрита е неадитивността на сигнала с липса на окислител
Анисимович, Дейнека и др.	Моделни решения	Предложени са кинетични параметри за оценка на AOA.

Бележки: конвенционално етикетирани: FIA-поточен инжекционен анализ, TPTZ-трипиридилтриазин, DIP-2,2, -дипиридил, PHEN-o-фенантролин, DPA-пиридиндикарбоксилна киселина, FZ-ферозин, AA-аскорбинова киселина, CT-катехол, t - време на експозиция, мин.

Взаимодействие между протеини и полиелектролити във водни разтвори

Различни методи за анализ се използват за характеризиране на протеин-полиелектролитни комплекси. Инструменталните методи предоставят информация за структурни и оптични свойства, както и определят динамиката и характера на свързването на PEC...

Ефект на d-метални съединения върху скоростта на дисоциация на водна молекула в биполярна мембрана

В процеса на синтезиране на нови BPM трябва да се обърне голямо внимание на изследването на свойствата на получените проби за последващ избор на условия за синтез, които осигуряват подобряване на електрохимичните характеристики на синтезираните мембрани...

Дизайнерски наркотици и синтетични канабиноиди

Откриването на синтетични канабиноиди в растителни смеси може да се извърши чрез различни физикохимични методи, като хроматография-масспектрометрия, газова, тънкослойна и високоефективна течна хроматография...

Разработване на метод за определяне на флавоноиди в лечебни растителни суровини

Синтез и фармакологични свойства на хинолинони-2

Обект на изследване: Хинолинон-2. Метод на изследване: С помощта на компютърната програма "Marvin JS" е създадена структурата на веществото. След това тя беше изпратена на сайта "http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php" за допълнително разследване...

Термоспектрален метод за изследване на продуктите от изпаряването на епоксиден полимер

Технология за получаване на високо пречистен хитозан от черупки на ракообразни

Определяне на молекулното тегло на хитозана. Молекулното тегло на хитозана се определя вискозиметрично съгласно стандартната процедура. Разтвори с концентрация от 0,05 и 0,5 g/dl се приготвят чрез разтваряне на претеглена част от полимерния прах в ацетатен буфер (0...

Физико-географска характеристика на територията на природния парк

Раздели