Микроскопски методи на изследване. Микроскопски методи

У дома

Водоснабдяване

Микроскопски методи на изследване- начини за изследване на различни обекти с помощта на микроскоп. В биологията и медицината тези методи позволяват да се изследва структурата на микроскопични обекти, чиито размери са извън разделителната способност на човешкото око. Основата е светлинна и електронна микроскопия. В практическа и научна дейност лекарите от различни специалности - вирусолози, микробиолози, цитолози, морфолози, хематолози и др., освен конвенционалната светлинна микроскопия, използват фазово-контрастна, интерференционна, луминесцентна, поляризационна, стереоскопична, ултравиолетова, инфрачервена микроскопия. Тези методи се основават на различни свойства на светлината. При електронната микроскопия изображението на изучаваните обекти възниква поради насочения поток от електрони.

За светлинна микроскопия и други базирани на нея микроскопски методи на изследванеопределяща стойност освен резолюция микроскопима характера и посоката на светлинния лъч, както и особеностите на изследвания обект, който може да бъде прозрачен и непрозрачен. В зависимост от свойствата на обекта се променят физическите свойства на светлината - нейният цвят и яркост, свързани с дължината и амплитудата на вълната, фазата, равнината и посоката на разпространение на вълната. Относно използването на тези свойства на светлината, различни микроскопски методи на изследване. За светлинна микроскопия биологичните обекти обикновено се оцветяват, за да се разкрият едно или друго от техните свойства ( ориз. един ). В този случай тъканите трябва да бъдат фиксирани, т.к. оцветяването разкрива определени структури само от убити клетки. В жива клетка багрилото се изолира в цитоплазмата под формата на вакуола и не оцветява нейната структура. Въпреки това, живите биологични обекти могат да бъдат изследвани и в светлинен микроскоп, като се използва методът на виталната микроскопия. В този случай се използва кондензатор с тъмно поле, който е вграден в микроскопа.

Фазово-контрастната микроскопия се използва и за изследване на живи и неоцветени биологични обекти. Тя се основава на дифракцията на лъч светлина в зависимост от характеристиките на радиационния обект. Това променя дължината и фазата на светлинната вълна. Обективът на специален фазово-контрастен микроскоп съдържа полупрозрачна фазова пластина. Живи микроскопични обекти или фиксирани, но неоцветени микроорганизми и клетки, поради своята прозрачност, практически не променят амплитудата и цвета на светлинния лъч, преминаващ през тях. причинявайки само фазово изместване на нейната вълна. Въпреки това, след преминаване през изследвания обект, светлинните лъчи се отклоняват от полупрозрачната фазова плоча. В резултат на това възниква разлика в дължината на вълната между лъчите, преминали през обекта, и лъчите на светлия фон. Ако тази разлика е поне 1/4 от дължината на вълната, тогава се появява визуален ефект, при който тъмен обект се вижда ясно на светъл фон или обратно, в зависимост от характеристиките на фазовата плоча.

Интерференционната микроскопия решава същите проблеми като фазово-контрастната микроскопия. Но ако последното ни позволява да наблюдаваме само контурите на обектите на изследване, тогава с помощта на интерференционна микроскопия е възможно да се изследват детайлите на прозрачен обект и да се извърши техния количествен анализ. Това се постига чрез разклоняване на лъч светлина в микроскоп: единият лъч преминава през частицата на наблюдавания обект, а другият минава покрай него. В окуляра на микроскопа и двата лъча са свързани и си пречат един на друг. Получената фазова разлика може да бъде измерена чрез определяне по този начин. много различни клетъчни структури. Последователното измерване на фазовата разлика на светлината с известни коефициенти на пречупване дава възможност да се определи дебелината на живите обекти и нефиксираните тъкани, концентрацията на вода и сухо вещество в тях, съдържанието на протеини и др. Въз основа на данните от интерференционната микроскопия може косвено да се съди за пропускливостта на мембраните, активността на ензимите и клетъчния метаболизъм на изследваните обекти.

Поляризиращата микроскопия дава възможност за изследване на обекти на изследване в светлина, образувана от два лъча, поляризирани във взаимно перпендикулярни равнини, т.е. в поляризирана светлина. За целта се използват филмови поляроиди или призми на Nicol, които се поставят в микроскоп между източника на светлина и препарата. Поляризацията се променя при преминаване (или отражение) на светлинни лъчи през различни структурни компоненти на клетките и тъканите, чиито свойства са нехомогенни. В така наречените изотропни структури скоростта на разпространение на поляризирана светлина не зависи от равнината на поляризация; в анизотропните структури скоростта на разпространение варира в зависимост от посоката на светлината по надлъжната или напречната ос на обекта. Ако коефициентът на пречупване на светлината по протежение на структурата е по-голям, отколкото в напречната посока, възниква положително двойно пречупване, с обратни отношения - отрицателно двойно пречупване. Много биологични обекти имат строга молекулярна ориентация, анизотропни са и имат положително двойно пречупване на светлината. Такива свойства притежават миофибрилите, ресничките на ресничестия епител, неврофибрилите, колагеновите влакна и др. ориз. 2 ). Поляризиращата микроскопия е една от хистологични методи на изследване,начин микробиологична диагностика,намира приложение в цитологични изследванияи др. В този случай в поляризирана светлина е възможно да се изследват както оцветени, така и неоцветени и нефиксирани, така наречените нативни препарати от тъканни срезове.

Флуоресцентната микроскопия се използва широко. Тя се основава на свойството на някои вещества да дават луминесценция – луминесценция в UV лъчи или в синьо-виолетовата част на спектъра. Много биологични вещества, като прости протеини, коензими, някои витамини и лекарства, имат собствена (първична) луминесценция. Други вещества започват да светят само когато към тях се добавят специални багрила - флуорохроми (вторична луминесценция). Флуорохромите могат да бъдат дифузно разпределени в клетката или селективно да оцветяват отделни клетъчни структури или определени химични съединения на биологичен обект. Това е основата за използването на луминесцентна микроскопия в цитологични и хистохимични изследвания (вж. Хистохимични методи на изследване). С помощта на имунофлуоресценция във флуоресцентен микроскоп се откриват вирусни антигени и концентрацията им в клетките, идентифицират се вируси, определят се антигени и антитела, хормони, различни метаболитни продукти и др. ( ориз. 3 ). В тази връзка луминесцентната микроскопия се използва при лабораторната диагностика на инфекции като херпес, паротит, вирусен хепатит, грип и др., използва се при бърза диагностика на респираторни вирусни инфекции, изследване на отпечатъци от носната лигавица на пациентите и при диференциална диагноза на различни инфекции. В патоморфологията с помощта на луминесцентна микроскопия злокачествените тумори се разпознават в хистологични и цитологични препарати, областите на исхемия на сърдечния мускул се определят в ранните стадии на инфаркт на миокарда, амилоидът се открива в тъканни биопсии и др.

Ултравиолетовата микроскопия се основава на способността на определени вещества, които изграждат живи клетки, микроорганизми или фиксирани, но не оцветени, прозрачни тъкани във видима светлина, да абсорбират UV лъчение с определена дължина на вълната (400-250 nm). Това свойство притежават високомолекулни съединения, като нуклеинови киселини, протеини, ароматни киселини (тирозин, триптофан, метилаланий), пуринови и пирамидинови основи и др. С помощта на ултравиолетова микроскопия локализацията и количеството на тези вещества се изясняват и в случай на изучаване на живи обекти, техните промени в процеса на живот.

Инфрачервената микроскопия ви позволява да изучавате обекти, които са непрозрачни за видимата светлина и UV радиацията, като поглъщате светлина с дължина на вълната 750-1200 от техните структури. nm. За инфрачервена микроскопия не се изисква предварителна химическа обработка на пробите. Този вид микроскопски методи на изследваненай-често се използва в зоологията, антропологията и други клонове на биологията. В медицината инфрачервената микроскопия се използва главно в невроморфологията и офталмологията.

Стереоскопската микроскопия се използва за изследване на обемни обекти. Дизайнът на стереоскопичните микроскопи ви позволява да видите обекта на изследване с дясното и лявото око от различни ъгли. Изследвайте непрозрачни обекти при сравнително ниско увеличение (до 120x). Стереоскопската микроскопия се използва в микрохирургия,по патоморфология със специално изследване на биопсичен, хирургичен и секционен материал, в криминалистично лабораторно изследване.

Електронната микроскопия се използва за изследване на структурата на клетките, тъканите на микроорганизмите и вирусите на субклетъчно и макромолекулно ниво. Този M.m.i. позволи да се премине към качествено ново ниво на изучаване на материята. Намира широко приложение в морфологията, микробиологията, вирусологията, биохимията, онкологията, генетиката, имунологията.Рязко увеличаване на разделителната способност на електронния микроскоп се осигурява от потока от електрони, преминаващи във вакуум през електромагнитни полета, създадени от електромагнитни лещи. Електроните могат да преминават през структурите на изследвания обект (трансмисионна електронна микроскопия) или да се отразяват от тях (сканираща електронна микроскопия), като се отклоняват под различни ъгли, което води до изображение на луминесцентния екран на микроскопа. С трансмисионна (трансмисионна) електронна микроскопия се получава планарно изображение на структурите ( ориз. 4 ), със сканиране - обемно ( ориз. 5 ). Комбинацията от електронна микроскопия с други методи, като авторадиография, хистохимия, имунологични методи за изследване,позволява извършване на електронно-радиоавтографски, електронно-хистохимични, електронно-имунологични изследвания.

Електронната микроскопия изисква специална подготовка на обектите на изследване, по-специално химическо или физическо фиксиране на тъкани и микроорганизми. Биопсичният материал и секционният материал след фиксиране се дехидратират, изсипват се в епоксидни смоли, нарязват се със стъклени или диамантени ножове на специални ултратоми, които дават възможност за получаване на ултратънки тъканни срезове с дебелина 30-50 nm. Те се контрастират и след това се изследват под електронен микроскоп. В сканиращ (растер) електронен микроскоп повърхността на различни обекти се изследва чрез отлагане на електрон-плътни вещества върху тях във вакуумна камера и се изследват така наречените реплики, които повтарят контурите на пробата. Вижте също

Основният метод за изследване на биологични микрообекти е светлинната и електронната микроскопия, които се използват широко в експерименталната и клиничната практика.

Микроскопията е основният метод за изследване на микрообекти, използван в биологията повече от 300 години. За изследване на хистологични препарати се използват различни видове светлинни микроскопи и електронни микроскопи. От създаването и използването на първите микроскопи те непрекъснато се подобряват. Съвременните микроскопи са сложни оптични системи с висока разделителна способност. Размерът на най-малката структура, която може да се види с микроскоп, се определя от най-малкото разрешимо разстояние (d), което зависи главно от дължината на вълната на светлината (λ) и дължината на вълната на електромагнитните трептения на потока от електрони и т.н. Тази зависимост се определя приблизително по формулата д= λ/2. По този начин, колкото по-къса е дължината на вълната, толкова по-малко е разделимото разстояние и толкова по-малки са микроструктурите, които могат да се видят в препарата.

Светлинна микроскопия.За изследване на хистологични микрообекти се използват обикновени светлинни микроскопи и техните разновидности, в които се използват източници на светлина с вълни с различна дължина на вълната. При конвенционалните светлинни микроскопи източникът на осветление е естествена или изкуствена светлина (фиг. 2.1). Минималната дължина на вълната на видимата част от спектъра е приблизително 0,4 µm. Следователно, за конвенционален светлинен микроскоп, най-малкото разрешимо разстояние е приблизително 0,2 µm, а общото увеличение (обективно увеличение, умножено на увеличението на окуляра) може да бъде 1500-2500.

Така с помощта на светлинен микроскоп могат да се видят не само отделни клетки с размери от 4 до 150 микрона, но и техните вътреклетъчни структури - органели, включвания. За подобряване на контраста на микрообектите се използва тяхното оцветяване.

ултравиолетова микроскопия.Това е вид светлинна микроскопия. Ултравиолетовият микроскоп използва по-къси ултравиолетови лъчи с дължина на вълната около 0,2 микрона. Разрешимото разстояние тук е 2 пъти по-малко, отколкото при конвенционалните светлинни микроскопи, и е приблизително 0,1 μm. Изображението, получено в ултравиолетови лъчи, невидими за окото, се преобразува във видимо чрез регистриране върху фотографска плоча или с помощта на специални устройства (луминесцентен екран, електронно-оптичен преобразувател).

Флуоресцентна (луминесцентна) микроскопия.Явленията на флуоресценцията се крият във факта, че атомите и молекулите на редица вещества, абсорбиращи краткотрайно

Ориз. 2.1.Микроскопи за биологични изследвания:

а- светлинен биологичен микроскоп "Biolam-S": 1 - основа; 2 - държач на тръбата; 3 - наклонена тръба; 4 - окуляр; 5 - револвер; 6 - лещи; 7 - маса; 8 - кондензатор с ирисова диафрагма; 9 - винт на кондензатора; 10 - огледало; 11 - микрометърен винт; 12 - макрометричен винт; б- електронен микроскоп EMV-100AK със система за автоматизирана обработка на изображения: 1 - микроскопска колона (с електронно-оптична система и камера за проби); 2 - контролен панел; 3 - камера с луминесцентен екран; 4 - блок за анализ на изображението; 5 - сензор за видеосигнал; в- конфокален микроскоп: 1 - светлинен микроскоп; 2 - записващо устройство (фотоелектронен умножител);

3 - сканиращо устройство за преместване на светлинния лъч по оста X, Y, Z;

4 - захранване и шкаф за лазерно управление; 5 - компютър за обработка на изображения

вълнови лъчи, преминават във възбудено състояние. Обратният преход от възбудено състояние към нормално състояние става с излъчване на светлина, но с по-голяма дължина на вълната. Във флуоресцентен микроскоп като източници на светлина за възбуждане на флуоресценция се използват живачни или ксенонови лампи с ултра високо налягане, които имат висока яркост в спектралната област от 0,25–0,4 μm (близки ултравиолетови лъчи) и 0,4–0,5 μm (синя светлина). лилави лъчи). Дължината на вълната на флуоресцентната светлинна вълна винаги е по-голяма от дължината на вълната на възбуждащата светлина, така че те се разделят с помощта на светлинни филтри и изображението на обекта се изучава само в светлината на флуоресценция. Разграничаване на собствена, или първична, и индуцирана, или вторична, флуоресценция. Всяка клетка на жив организъм има своя собствена флуоресценция, но често е изключително слаба.

Серотонинът, катехоламините (адреналин, норадреналин), съдържащи се в нервните, мастните и други клетки, имат първична флуоресценция след фиксиране на тъканта във формалдехидни пари при 60-80 °C (метод на Фолк).

Вторичната флуоресценция възниква, когато препаратите се третират със специални багрила - флуорохроми.

Има различни флуорохроми, които специфично се свързват с определени макромолекули (акридин портокал, родамин, флуоресцеин и др.). Например, когато лекарствата се третират с акридиново оранжево, ДНК и нейните съединения в клетките имат ярко зелено сияние, докато РНК и нейните производни имат яркочервен блясък. Има много багрила, които могат да се използват за идентифициране на протеини, липиди, вътреклетъчен калций, магнезий, натрий и др. Така спектралният състав на радиацията носи информация за вътрешната структура на обекта и неговия химичен състав. Вариант на метода на флуоресцентна микроскопия, при който както възбуждането, така и флуоресцентното излъчване се появяват в ултравиолетовата област на спектъра, се нарича метод на ултравиолетова флуоресцентна микроскопия.

За да увеличите контраста на флуорохромните обекти, конфокален вариантоптичен микроскоп (виж фиг. 2.1, в). Като осветление се използва лъч монохроматична светлина с малък диаметър, който създава лазерен източник. Във всеки момент от време малка площ (обем) на клетката е във фокуса на микроскопа. Лъчът светлина се движи над обекта (сканира обекта по осите X, Y, Z).При всяко движение на светлинния лъч по една от сканиращите линии се получава информация за изследваната структура, разположена в дадена точка (обем) по линията на сканиране (оптичен участък на клетката), например за локализацията на протеини в микротубулите в клетката. Цялата информация, получена от всяка точка за сканиране на клетка, се предава на компютър, комбинира се с помощта на специална програма и се показва на екрана на монитора под формата на контрастно изображение. С помощта на този метод на микроскопия се получава информация за формата на клетките, цитоскелета, структурата на ядрото, хромозомите и т. н. С помощта на компютърна програма, на базата на информацията, получена за всяка линия на сканиране, се създава триизмерно изображение на клетката, което ви позволява да видите клетката от различни зрителни ъгли.

Фазова контрастна микроскопия.Този метод се използва за получаване на висококонтрастни изображения на прозрачни и безцветни живи обекти, които са невидими с конвенционалните методи за микроскопия. Методът се основава на факта, че светлината, преминавайки през структури с различни показатели на пречупване, променя скоростта си. Конструкцията на използваната оптика на микроскопа дава възможност да се преобразуват фазовите промени на светлината, преминаваща през неоцветения препарат, които не се възприемат от окото, в промени в неговата амплитуда, т.е. яркостта на полученото изображение. Фазовият контрастен метод осигурява контраста на изследваните неоцветени структури благодарение на специална пръстеновидна диафрагма, поставена в кондензатора и т. нар. фазова пластина, разположена в обектива. Разновидност на метода на фазовия контраст е методът на контраста на фаза-тъмно поле, който дава отрицателно изображение в сравнение с положителен фазов контраст.

Микроскопия с тъмно поле.В микроскоп с тъмно поле само светлината, която дава дифракция (огъване на вълни) на структурите в препарата, достига целта. Това се случва поради наличието на специален кондензатор в микроскопа, който осветява препарата със строго наклонена светлина; лъчите от осветителя са насочени отстрани. Така полето изглежда тъмно, а малките частици в препарата отразяват светлината, която след това навлиза в лещата. В клиниката този метод се използва за изследване на кристали в урината (пикочна киселина, оксалати), за демонстриране на спирохети, по-специално Treponema pallidum,причинявайки сифилис и др.

интерференционна микроскопия.Разновидност на фазовия контрастен микроскоп е интерференционният микроскоп, който е предназначен за количествено определяне на тъканната маса. Диференциален интерференционен микроскоп (с оптика Nomarsky) се използва за изследване на релефа на повърхността на клетките и други биологични обекти.

В интерференционния микроскоп светлинният лъч от осветителя се разделя на два потока: единият преминава през обекта и променя фазата на трептене, а вторият заобикаля обекта. В призмите на обектива и двата лъча се наслагват един върху друг. В резултат на това се изгражда изображение, в което участъци от микрообект с различна дебелина и плътност се различават по контраст. След количествено определяне на промените, определете концентрацията и масата на сухото вещество.

Фазово-контрастните и интерференционните микроскопи ви позволяват да изучавате живи клетки.Те използват интерференцията, която възниква, когато два набора вълни се комбинират, за да създадат изображение на микроструктури. Предимството на фазово-контрастната, интерференционната и микроскопията с тъмно поле е способността да се наблюдават клетките в процеса на движение и митоза. В този случай движението на клетката може да бъде записано с помощта на микровидео заснемане на времетраене (кадър по кадър).

поляризационна микроскопия.Поляризиращият микроскоп е модификация на светлинен микроскоп, в който са инсталирани два поляризиращи филтъра: първият (поляризатор) - между светлинния лъч и обекта, а вторият (анализатор) - между лещата на обектива и окото. Светлината преминава през първия филтър само в една посока, вторият филтър има главна ос,

който е разположен перпендикулярно на първия филтър и не пропуска светлина. Това създава ефект на тъмно поле. Структури, съдържащи надлъжно ориентирани молекули (колаген, микротубули, микрофиламенти) и кристални структури имат способността да въртят оста на светлинните лъчи, излъчвани от поляризатора. Когато оста на въртене се промени, тези структури изглеждат светещи на тъмен фон. Способността на кристалите или паракристалните образувания да разделят светлинна вълна на обикновена вълна и вълна, перпендикулярна на нея, се нарича двойно пречупване. Тази способност се притежава от фибрилите на набраздените мускули.

Електронна микроскопия.Голяма стъпка напред в развитието на микроскопската технология е създаването и използването на електронния микроскоп (виж фиг. 2.1). Електронният микроскоп използва поток от електрони с по-къси дължини на вълната от светлинния микроскоп. При напрежение от 50 000 V дължината на вълната на електромагнитните трептения, възникващи от движението на поток от електрони във вакуум, е 0,0056 nm. Теоретично е изчислено, че разрешаваемото разстояние при тези условия може да бъде около 0,002 nm, или 0,000002 μm, т.е. 100 000 пъти по-малко, отколкото в светлинен микроскоп. На практика в съвременните електронни микроскопи разрешаваемото разстояние е около 0,1-0,7 nm.

В хистологията се използват трансмисионни (трансмисионни) електронни микроскопи (ТЕМ), сканиращи (сканиращи) електронни микроскопи (SEM) и техните модификации. С помощта на ТЕМ може да се получи само планарно изображение на изследвания микрообект. За да се получи пространствено представяне на структурите, се използват SEM, които могат да създадат триизмерно изображение. Сканиращият електронен микроскоп работи на принципа на сканиране на изследван обект с електронна микросонда, тоест той последователно "усеща" отделни точки от повърхността с рязко фокусиран електронен лъч. Това изследване на обект се нарича сканиране(четене) и моделът, по който се движи микросондата - растер.Полученото изображение се извежда на телевизионен екран, чийто електронен лъч се движи синхронно с микросондата.

Основните предимства на сканиращата електронна микроскопия са голяма дълбочина на полето, широк диапазон от непрекъснати промени в увеличението (от десетки до десетки хиляди пъти) и висока разделителна способност. Съвременните версии на инструменти за изследване на повърхността на обект са атомно-силовият микроскоп и сканиращият тунелен микроскоп.

Електронна микроскопия по метода на замразяване- чипингизползвани за изследване на детайлите на структурата на мембраните и междуклетъчните връзки. Клетките се замразяват при ниска температура (-160°C), за да се получат чипове. При изследване на мембраната равнината на разцепване минава през средата на липидния бислой. Освен това върху вътрешните повърхности на получените половини на мембраните се отлагат метали (платина, паладий, уран), те се изследват с помощта на ТЕМ и микрофотография.

Метод на криоелектронна микроскопия.Бързо замразен тънък слой (около 100 nm) от тъканна проба се поставя върху микроскопска решетка и се изследва под микроскоп под вакуум при -160°C.

Метод на електронна микроскопия "замразяване - ецване"използвани за изследване на външната повърхност на клетъчните мембрани. След бързо замразяване на клетките при много ниска температура, блокът се разцепва с острие на нож. Получените ледени кристали се отстраняват чрез сублимация на вода във вакуум. След това областите на клетките се засенчват чрез разпръскване на тънък филм от тежък метал (например платина). Методът дава възможност да се разкрие триизмерната организация на структурите.

По този начин методите за замразяване-разцепване и замразяване-ецване правят възможно изследването на нефиксирани клетки без образуване на индуцирани от фиксиране артефакти в тях.

Методите за контрастиране със соли на тежки метали дават възможност за изследване на отделни макромолекули - ДНК, големи протеини (например миозин) в електронен микроскоп. При отрицателно контрастиране се изследват агрегати от макромолекули (рибозоми, вируси) или протеинови нишки (актинови филаменти).

Електронна микроскопия на ултратънки срезове, получени чрез криоултрамикротомия.При този метод парчетата тъкан без фиксиране и изливане в твърда среда бързо се охлаждат в течен азот при температура от -196 °C. Това осигурява инхибиране на метаболитните процеси на клетките и прехода на водата от течна фаза в твърда. След това блоковете се нарязват на ултрамикротом при ниска температура. Този метод на разделяне обикновено се използва за определяне на активността на ензимите, както и за провеждане на имунохимични реакции. За откриване на антигени се използват антитела, свързани с частици колоидно злато, чиято локализация е лесна за идентифициране върху препарати.

Методи за ултрависоковолтова микроскопия.Използват се електронни микроскопи с ускорително напрежение до 3 000 000 V. Предимството на тези микроскопи е, че ви позволяват да изследвате обекти с голяма дебелина (1-10 микрона), тъй като при висока електронна енергия те се поглъщат по-малко от обекта. Стереоскопичното изображение позволява да се получи информация за триизмерната организация на вътреклетъчните структури с висока разделителна способност (около 0,5 nm).

Много е трудно да се отрече значението на науката в живота на цялото общество. Учените и техните разработки дадоха на обществото всичко, което то сега се радва и на което се радва. Развитието на учени в различни области позволява да се победят смъртоносни болести, да се борят с психични разстройства, да се създаде уникално „умно“ оборудване и дори роботи. Възможностите на науката са наистина безкрайни. Новите лица винаги носят със себе си нови идеи, които стават основа за бъдещи разработки. Въпреки това, много разработки се основават на прости и доказани методи.

Много мъдреци от миналото казваха, че съществува макро-, микрокосмос. На този етап на развитие хората не можеха да осъзнаят цялата дълбочина на тези думи. В крайна сметка макро- и микрокосмосът наистина съществуват и взаимодействат много тясно. Малки промени в структурата на клетките могат да бъдат причинени от глобални промени в Слънчевата система. Към днешна дата е много трудно да се докаже или опровергае подобна връзка, но изследванията на света на бактериите и клетките предполагат, че една клетка е малка Вселена.

Микроскопия

Микроскопията е науката за използване на микроскоп. В превод от гръцки тази дума означава „малък, малък“. Микроскопията може да бъде разделена на няколко подвида: оптична, многофотонна, рентгенова, лазерна и електронна. Целта на този метод на изследване е да повиши наблюдението на обекта и регистрирането на забелязаните промени.

История на микроскопа

В началото на своето историческо развитие микроскопите са тези, които използват видими светлинни лъчи. Такива устройства бяха много слаби за наблюдение и бяха подходящи само за най-простите операции. Идеята за появата на електронен микроскоп възникна в момента, когато учените помислиха за замяна на електромагнитното излъчване с електронен лъч. Това събитие беше за развитието на електронния микроскоп, който значително разшири възможностите за наблюдение на обекта.

Микроскопски методи

За да се изследва правилно и задълбочено всеки обект, е необходимо да се работи по определен алгоритъм. Такива алгоритми се разработват веднъж и се използват с години. За да изучаваме света около нас с помощта на специално оборудване, е необходимо да овладеем специални методи. Микроскопските методи са комбинация от различни алгоритми, следвайки които може да се изследва задълбочено и систематично конкретен обект от микросвета. Преминаването на лъч светлина през микроскоп е придружено от някои промени в първоначалните характеристики, които могат да бъдат причинени от структурната структура на обекта. Този процес може да бъде придружен от поредица от оптични ефекти като отражение, поглъщане, пречупване, дисперсия и др.

Методи на светлинна микроскопия

Светлинната микроскопия е система от методи, които използват различни оптични ефекти за надеждно показване на резултатите. Видимите елементи и естеството на полученото изображение до голяма степен ще зависят от осветлението. Като цяло има голям брой методи за микроскопия: светло поле, наклонено осветление, интерференционен контраст, тъмно поле, поляризационен метод, фазов контраст, ултравиолетова, луминесцентна, инфрачервена микроскопия, конфокален микроскоп.

Всички тези методи имат определени предимства и недостатъци. При работа с проба трябва да се избира един или друг метод въз основа на неговата адекватност в дадена ситуация. Силните и слабите страни на всеки метод не са важни като цяло, основното е методът да бъде приложим при дадени условия.

Микроскопия и медицина

Използването на микроскопията в медицината има голям потенциал. Днес, благодарение на микроскопите, е възможно да се изследват различни клетки на човешкото тяло, за да се определи точно здравословното състояние. Клетките на тялото дават най-точния и надежден резултат, който доскоро беше невъзможно да се получи, тъй като микроскопите не можеха да предоставят изчерпателна информация.

Използването на такива устройства е много обещаващо, тъй като методите на лечение и диагностика могат драстично да се променят и напълно да преминат на ново ниво. Изследванията с помощта на микроскопи са известни и използвани от дълго време, но науката е на прага да лекува човек с клетки. Това е уникална възможност, която ще ви позволи да се отдалечите от обичайните методи на лечение и да забравите за лекарствата. Клетката е най-мощният елемент в тялото. Просто е безсмислено да се говори за ползите от трансплантацията на здрави клетки на болен човек, защото това е очевидно.

Анализ на урината

Общият анализ на урината е набор от мерки, които са насочени към изследване на свойствата на урината и нейния физичен и химичен състав. Важни показатели в този случай са цвят, мирис, реакция, прозрачност, плътност, както и съдържанието на различни вещества в урината. Микроскопията на утайката на урината ви позволява да определите наличието на соли, клетъчни елементи и цилиндри. Трябва да се разбере, че урината е краен продукт от дейността на бъбреците, който може много точно да отразява състоянието на метаболитните процеси и кръвта в тялото.

Анализ на утайката на урината

Микроскопията на урината ви позволява да създадете по-пълна картина с пълно изследване на тялото. Също така, намазка често се използва за обичайна и диференциална диагноза на заболявания на пикочните пътища и бъбреците. По време на лечението може да се предпише микроскопия на урината, за да се оцени ефективността на намесата на лекаря. Анализът на урината ви позволява да идентифицирате специфични или потенциални проблеми във водния и електролитния баланс на тялото, както и в метаболитния процес. Анализът на урината е много ефективен при диагностициране на заболявания на стомашно-чревния тракт, както и при инфекциозни и възпалителни процеси в организма. Понякога микроскопията на урината се използва за наблюдение на състоянието на пациента по време на периода на терапевтично или хирургично лечение.

Изследване на кръв под микроскоп

Кръвните клетки се образуват в червения костен мозък и след това се освобождават в кръвния поток. Всеки изпълнява своята специфична функция. Левкоцитите са необходими за борба с инфекциозните клетки, еритроцитите допринасят за обогатяването на кислородните клетки и отстраняването на въглеродния диоксид от тях, тромбоцитите са много важни за хемостазата. При нормални условия човешкото тяло произвежда нормативната стойност на всички клетки, която не излиза извън определени граници. В случай на усложнения или заболяване кръвните клетки могат да променят своя размер, форма, цвят и количество. Само благодарение на точното микроскопско изследване е възможно да се определи състоянието на клетките и да се направят съответните заключения.

Кръвта е животворната течност на тялото, която осигурява обмена на полезни вещества между всички клетки. Микроскопията на кръвна намазка е изследване, което се извършва под микроскоп. Проучва се препарат, приготвен от една капка кръв. Тази процедура е включена в общия кръвен тест или формулата на левкоцитите и не се извършва отделно.

микроскопия на намазка

Какво е необходимо Микроскопията на кръвна намазка дава на специалиста много важни знания за състоянието на човешкото здраве. С този анализ можете да определите количественото съотношение на червените кръвни клетки, тромбоцитите, белите кръвни клетки, както и тяхната форма и размер. Освен това ви позволява да определите количествената експресия на незрели левкоцити, което е много важен момент при редица заболявания. Също така, кръвната намазка ви позволява да диагностицирате качествено заболявания, които могат да бъдат свързани с нарушени функции на кръвта, нейното образуване, коагулация и разрушаване, а също и при левкемия.

Кръвна намазка се предписва, ако общият кръвен тест покаже, че количествената експресия на левкоцити, незрели или атипични клетки е повишена. За намазка можете да използвате биоматериал от кръв или капиляри.

Биология и микроскопи

Биологията значително разширява възможностите за използване на микроскопи. Както споменахме по-рано, цитологията разчита в голяма степен на съвременни и мощни микроскопи. Микроскопията в биологията отваря безпрецедентно поле за експерименти и изследвания за учените. Съвременните разработки вече ни позволяват да говорим за това какво ни носи бъдещето.

Микроскопията в биологията има много широко приложение. Устройствата ни позволяват да изследваме организми, които са недостъпни за човешкото око, но са много важни за научни експерименти. В биологията най-често използваният метод е електронната микроскопия, която дава изображение поради насочения поток от електрони. В същото време дори светлинен микроскоп дава възможност за изследване на живи биологични обекти.

Методът на микроскопията в биологията се използва много активно, тъй като почти всички сортове са приложими за биологични изследвания. Интерференционната микроскопия дава възможност да се изследват прозрачни течности и обекти, както и да се даде техния качествен анализ. Това е възможно поради факта, че светлинният лъч, преминаващ през устройството, се разклонява: една част от него преминава през обекта, а другата част минава покрай него. Така двата лъча си пречат и се комбинират, за да дадат цялостно изображение.

Микроскопия в различни области на приложение

Обхватът на микроскопията е много широк. Въпреки факта, че първоначално микроскопите са били предназначени за изследвания в областта на биологията, днес тяхната сфера на влияние се разшири значително. Микроскопията е набор от методи, които са намерили своето приложение при анализа на твърди и кристални тела, структурата и структурите на повърхностите. Микроскопите също се използват активно в медицината не само за диагностика, но и за извършване на микрохирургични операции. Освен това е известно, че учените са разработили подводен лазерен микроскоп, чиято цел е да търсят извънземен живот на Европа.

Също така не бива да се забравя и бързото развитие на нанотехнологиите, които са немислими без микроскопи. Развитието на тази индустрия води до факта, че разновидностите на микроустройствата непрекъснато се подобряват. Освен това има нови, които са предназначени да изучават определена среда.

Обобщавайки някои резултати, трябва да се каже, че микроскопията е обещаваща област, която се развива все по-активно всяка година. Интересът към човешките стволови клетки, както и развитието на нанотехнологиите, води до факта, че микроскопите стават неразделна част от всяка изследователска работа.

В зависимост от свойствата на обекта светлината променя своите физически свойства – цвят (дължина на вълната), яркост (амплитуда на вълната), фаза, които се използват в съвременните микроскопи за създаване на контраст.

Ориз. 1. Микроскоп MBI-3: 1 - крак, или обувка; 2 - агнета на грубото движение на тръбата; 3 - държач на тръбата; 4 - окуляри; 5 - бинокулярна приставка; 6 - глава за закрепване на револвер със седалка за смяна на тръби; 7 - винт за закрепване на бинокуляра; 8 - револвер на плъзгач; 9 - лещи; 10 - предметна таблица; 11 - агнешко на надлъжното движение на държача на лекарството; 12 - агнешко на напречното движение на държача на лекарството; 13 - апланатичен кондензатор за директно и наклонено осветяване; 14 - винтове за центриране на масата; 15 - глава на винт, фиксираща горната част на сцената; 16 - скоба на кондензатора; 17 - агнешки микромеханизъм; 18 - огледало; 19 - кутия с микромеханизъм.

Най-лесно податливи на оцветяване са фиксираните, убити препарати. Такива неподвижни препарати могат да се разглеждат и снимат с висока точност под микроскоп, но те не дават възможност за оценка на различни форми на жизнена активност на микроскопичен обект (движение, сливане, фагоцитоза и др.). Известни са багрила, които се свързват с живите клетки, без да нарушават жизнените им функции.

жизненоважен(жизненоважната) микроскопия показва, че много живи клетъчни структури се променят относително малко с умело фиксиране и последващо оцветяване. Това потвърждава високата научна стойност на информацията, получена чрез микроскопия на оцветени предмети. Виталната микроскопия е възможна и без оцветяване, ако в конвенционален микроскоп се въведе така наречения кондензатор с тъмно поле. Той осветява обекта по такъв начин, че само онези лъчи, които са разпръснати върху частиците на обекта и по този начин променят посоката на разпространението си, влизат в окото на наблюдателя. Лъчи, които преминават през фона без да се разсейват, не влизат в окото. Следователно, частиците на обекта светят и се открояват ярко на тъмен фон (тъмно поле). Частиците на обекта са ясно видими, дори ако размерите им са по-малки от разрешеното разстояние.

Тъмно полемикроскопията осигурява възможно най-голям контраст на изображението, но нейната яснота и полезно увеличение са значително по-ниски, отколкото при конвенционалната микроскопия. Микроскопията с тъмно поле се използва успешно за изследване на спирохети, лептоспири и други слабо оцветяващи микроорганизми. При работа с хистологични препарати не е приложимо.

Технически независима версия на микроскопията с тъмно поле е ултрамикроскопия, при който най-малките изследвани частици са осветени от мощен страничен лъч светлина и се виждат като точки на черен фон. Ултрамикроскопията дава възможност за преброяване на частици, оценка на техните размери и други свойства. Използва се за изследване на колоидни разтвори, аерозоли, суспензии.

През последните години все по-рядко се използва микроскопията с тъмно поле, тъй като се появиха два нови вида контрастни устройства със значително по-добри характеристики – фазово-контрастни (фиг. 2, а и б) и амплитудно-контрастни микроскопи. Технически са сходни, но използват различни варианти на светлинния лъч в обекта. Лъчът, преминаващ през фона на пробата, в идеалния случай не претърпява никакви промени. Той преминава през точно определени области на лещата. Лъчът, преминаващ през обекта, се подлага на дифракция, т.е. той се разпада на лъчи с намаляващ интензитет, които излизат от обекта под различни ъгли. Други свойства на лъча (амплитуда, дължина на вълната, фаза) варират в различна степен в зависимост от характеристиките на обекта.

Ориз. Фиг. 2. Микроскоп МБИ-3 (а) с фазово-контрастно устройство КФ-1 (б): 1 - кондензатор на въртящата се система; d - комплект лещи и пръстеновидни диафрагми; 3 - спомагателен микроскоп.

Почти всички живи микроскопични обекти изглеждат едва забележими, прозрачни в обикновен микроскоп, защото почти не променят нито амплитудата, нито цвета на лъча, който е преминал през тях.

Те променят само фазата на нейната вълна, но тази промяна не се улавя нито от окото, нито от фотографската плоча. Сноп от лъчи, дифрагирани от обекта и изместени от него във фаза, преминава през онези части на лещата, където не могат да преминат директни, недифрагирани фонови лъчи. На практика е лесно да се определи точно къде ще преминат тези лъчи. Ако тази област е покрита с една от лещите на обектива с полупрозрачна плоча, способна да променя фазата, интензитета, цвета или всичките тези три свойства заедно, тогава фоновото изображение ще промени фазата си, яркостта му ще намалее или цветът ще се промени. Лъчите, които са преминали през обекта и са били отклонени (дифрагирани) от него, ще заобиколят поставената в лещата плоча и следователно няма да придобият свойствата, които фоновите лъчи са придобили след преминаване през плочата. В резултат на това разликата между лъчите на фона и обекта ще се увеличи. Ако фазовата разлика между лъчите на фона и обекта достигне 1/4 от дължината на вълната, тогава в крайното изображение има забележим контраст за окото и фотографската плоча: тъмен обект на светъл фон или, обратно, в зависимост от структурата на плочата, която в този случай се нарича "фаза" . Ако плочата променя основно яркостта и цвета на фона, тогава такъв микроскоп трябва да се нарече амплитудно-контрастен микроскоп (по-краткото, макар и не съвсем правилно, име "аноптрал" стана по-широко разпространено). По този начин разликата между фазово-контрастния и амплитудно-контрастния микроскоп се определя от свойствата на плочата в обектива, което променя свойствата на недифрагираните фонови лъчи. Изображенията, произведени от тези микроскопи, са много по-ярки и по-богати на детайли (фигури 3 и 4) от изображенията в тъмно поле.

Ориз. 3. Култура на многоклетъчната бактерия Caryophanon latum Peshkoff. Амплитудно-контрастна микроскопия.
Ориз. 4. Микроколонии от вас. мегатериум, заразен с фага. Амплитудно-контрастна микроскопия.

С появата на фазово- и амплитудно-контрастните микроскопи виталната микроскопия получи отлична техническа и методологична база, чиито възможности са близо до предела за светлинната оптика. Тези устройства не изискват никакво фиксиране или оцветяване на обекта. Съвременната витална микроскопия значително разшири познанията ни за поведението и динамиката на живите микрообекти в естествени и лабораторни условия на местообитание и експеримент. Ускореното (бързо) и бавно (времево) микрофилмиране е достъпно за изследователски процеси, чийто скорост на потока е твърде висок или твърде нисък за визуално наблюдение.

Предлаганите в търговската мрежа фазово-контрастни и амплитудно-контрастни (анотрални) устройства са евтини и могат лесно да се монтират на търговски микроскопи; използването им не е трудно. Тези устройства несъмнено ще намерят нови области на приложение както в научните изследвания, така и в медицинската практика.

ултравиолетова микроскопиясе основава на способността на някои вещества да абсорбират селективно ултравиолетовите лъчи с определена дължина на вълната. Това ви позволява визуално да демонстрирате и изучавате, включително количествено, разпределението на веществата в живи клетки или фиксирани препарати. Така, например, протеините и нуклеиновите киселини са еднакво прозрачни за видимата светлина; гледайки неоцветена клетка във видима светлина, е невъзможно да се определи къде се намира протеинът или нуклеиновата киселина. Но нуклеиновата киселина абсорбира ултравиолетовите лъчи с определена дължина много по-силно от протеина. Следователно в ултравиолетов микроскоп зоната, съдържаща нуклеиновата киселина, изглежда много по-тъмна. Тъй като ултравиолетовите лъчи не се възприемат директно от окото, е необходимо да се използват специални светлинни преобразуватели. Ултравиолетовата микроскопия е технически много по-сложна от обикновената светлинна микроскопия, оборудването й е по-скъпо и техниката е по-тънка. Въпреки това използването му е оправдано, тъй като научното значение на бързото топографско описание на химичния състав на жива клетка е много голямо.

Луминесцентната микроскопия е много по-достъпна и обещаваща (вижте), която сега се използва широко в изследователските и клинично-диагностичните лаборатории. В същото време жив обект се обработва със специални багрила, които при осветяване със синя, виолетова или ултравиолетова светлина започват да светят, излъчвайки по-дълги дължини на вълната (зелено, жълто). Цветът на възбуденото вторично сияние зависи от химичните свойства на обекта и багрилото, въведено в него.

Поляризираща микроскопиясе основава на промяна в равнината на трептене на светлинна вълна след преминаване през кристали. Не се използва в практическата медицина.

Съвременната микроскопия изисква използването на разнообразно спомагателно оборудване. Нагревателните маси и термостатите дават възможност за поддържане и наблюдение на обект за дълго време при дадена температура. За продължително култивиране на микроби или тъканни култури се използват различни микрокамери в зрителното поле на здрава леща. Очни и обективни микрометри правят възможни точни измервания на микрообекти. Индустрията произвежда микроманипулатори (виж) за операции с микрообекти. За получаване на стереоскопично изображение при увеличения до 100 пъти са предназначени бинокулярни лупи (виж) и стереомикроскопи (фиг. 5). Широко се произвежда и използва оборудване за микрофотография и микрокинозаснемане (фиг. 6). Вижте също Микроскопска техника.

Ориз. 5. Стереоскопичен микроскоп МБС-1.

Ориз. 6. Микрофилмна инсталация МКУ-1.

Микроскопски методи на изследване- начини за изследване на различни обекти с помощта на микроскоп. В биологията и медицината тези методи позволяват да се изследва структурата на микроскопични обекти, чиито размери са извън разделителната способност на човешкото око. Основата на M.m.i. е светлинна и електронна микроскопия. В практическа и научна дейност лекарите от различни специалности - вирусолози, микробиолози, цитолози, морфолози, хематолози и др., освен конвенционалната светлинна микроскопия, използват фазово-контрастна, интерференционна, луминесцентна, поляризационна, стереоскопична, ултравиолетова, инфрачервена микроскопия. Тези методи се основават на различни свойства на светлината. При електронната микроскопия изображението на изучаваните обекти възниква поради насочения поток от електрони.

За светлинна микроскопия и други M.m.i. определяща стойност освен резолюция микроскоп има характера и посоката на светлинния лъч, както и особеностите на изследвания обект, който може да бъде прозрачен и непрозрачен. В зависимост от свойствата на обекта се променят физическите свойства на светлината - нейният цвят и яркост, свързани с дължината и амплитудата на вълната, фазата, равнината и посоката на разпространение на вълната. Различни M.m.i. са изградени върху използването на тези свойства на светлината. За светлинна микроскопия биологичните обекти обикновено се оцветяват, за да се разкрият едно или друго от техните свойства ( ориз. един ). В този случай тъканите трябва да бъдат фиксирани, т.к. оцветяването разкрива определени структури само от убити клетки. В жива клетка багрилото се изолира в цитоплазмата под формата на вакуола и не оцветява нейната структура. Въпреки това, живите биологични обекти могат да бъдат изследвани и в светлинен микроскоп, като се използва методът на виталната микроскопия. В този случай се използва кондензатор с тъмно поле, който е вграден в микроскопа.

отколкото в напречната посока се получава положително двойно пречупване, при обратни отношения - отрицателно двойно пречупване. Много биологични обекти имат строга молекулярна ориентация, анизотропни са и имат положително двойно пречупване на светлината. Такива свойства притежават миофибрилите, ресничките на ресничестия епител, неврофибрилите, колагеновите влакна и др. ориз. 2 ). Поляризиращата микроскопия е една от хистологични методи на изследване, начин микробиологична диагностика, намира приложение в цитологични изследвания и др. В този случай в поляризирана светлина е възможно да се изследват както оцветени, така и неоцветени и нефиксирани, така наречените нативни препарати от тъканни срезове.

Флуоресцентната микроскопия се използва широко. Тя се основава на свойството на някои вещества да дават луминесценция – луминесценция в UV лъчи или в синьо-виолетовата част на спектъра. Много биологични вещества, като прости протеини, коензими, някои витамини и лекарства, имат собствена (първична) луминесценция. Други вещества започват да светят само когато към тях се добавят специални багрила - флуорохроми (вторична луминесценция). Флуорохромите могат да бъдат дифузно разпределени в клетката или селективно да оцветяват отделни клетъчни структури или определени химични съединения на биологичен обект. Това е основата за използването на луминесцентна микроскопия в цитологични и хистохимични изследвания (вж. Хистохимични методи на изследване ). С помощта на имунофлуоресценция във флуоресцентен микроскоп се откриват вирусни антигени и концентрацията им в клетките, идентифицират се вируси, определят се антигени и антитела, хормони, различни метаболитни продукти и др. ( ориз. 3 ). В тази връзка луминесцентната микроскопия се използва в лабораторната диагностика на инфекции като вирусни и др., използва се при бърза диагностика на респираторни вирусни инфекции, изследване на отпечатъци от носната лигавица на пациентите и при диференциална диагностика на различни инфекции. В патоморфологията с помощта на флуоресцентна микроскопия злокачествените тумори се разпознават в хистологични и цитологични препарати,

определяне на области на исхемия на сърдечния мускул в ранните стадии на инфаркт на миокарда, откриване на амилоид в проби от тъканна биопсия и др.

Инфрачервената микроскопия ви позволява да изучавате обекти, които са непрозрачни за видимата светлина и UV радиацията, като поглъщате светлина с дължина на вълната 750-1200 от техните структури. nm. За инфрачервена микроскопия не се изисква предварителна химическа обработка на пробите. Този тип M.m.i. най-често се използва в зоологията, антропологията и други клонове на биологията. В медицината инфрачервената микроскопия се използва главно в невроморфологията и офталмологията.

Стереоскопската микроскопия се използва за изследване на обемни обекти. Дизайнът на стереоскопичните микроскопи ви позволява да видите обекта на изследване с дясното и лявото око от различни ъгли. Изследвайте непрозрачни обекти при сравнително ниско увеличение (до 120x). Стереоскопската микроскопия се използва в микрохирургия, по патоморфология със специално изследване на биопсичен, хирургичен и секционен материал, в криминалистично лабораторно изследване.

Секции