Acasă

Livnevnevka

Metoda chemiluminiscentă pentru determinarea Antioxidanților (AO). Metodă de determinare a activității antioxidante totale Determinarea activității antioxidante a mierii prin chemiluminiscență

Metoda chemiluminiscentă pentru determinarea Antioxidanților (AO). Metodă de determinare a activității antioxidante totale Determinarea activității antioxidante a mierii prin chemiluminiscență

Invenţia se referă la industria alimentară şi poate fi utilizată la determinarea activităţii antioxidante totale. Metoda se efectuează după cum urmează: analitul interacționează cu reactivul 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-fenantrolină. Acidul ascorbic (AA) reacționează cu același reactiv, care este adăugat într-un raport de 1:100. Apoi, incubați timp de cel puțin 90 de minute și fotometrul la 510 ± 20 nm. După aceasta, se stabilește dependența mărimii semnalului analitic de cantitatea de substanță și se calculează valoarea AOA totală. Metoda prezentată face posibilă determinarea mai puțin intensivă și mai fiabilă a activității antioxidante totale a materialelor vegetale și a produselor alimentare pe baza acestora. 2 salariu f-ly, 1 ill., 5 mese.

Invenția se referă la chimia analitică și poate fi utilizată în determinarea activității antioxidante totale (AOA) a materialelor vegetale și a produselor alimentare pe baza acesteia.

Există o metodă coulometrică cunoscută pentru determinarea AOA totală a ceaiului, bazată pe interacțiunea extractelor apoase ale produsului cu compușii brom generați electric (I.F.Abdulin, E.N. Turova, G.K. Budnikov. Evaluarea coulometrică a capacității antioxidante a extractelor de ceai cu electricitate). brom generat // Journal of Analyst. chimie. 2001. T.56. Nr. 6. P.627-629). Alegerea compușilor de brom electrogenerați ca titrant se datorează capacității lor de a intra în diferite reacții: radical, redox, substituție electrofilă și adăugare la legături multiple. Acest lucru ne permite să acoperim o gamă largă de compuși biologic activi ai ceaiului care au proprietăți antioxidante. Dezavantajele acestei metode sunt posibilitatea unei reacții de bromurare cu substanțe care nu sunt antioxidante, precum și exprimarea valorii rezultate a AOA total în unități de energie electrică (kC/100 g), ceea ce face dificilă evaluarea rezultatelor obținute.

Există o metodă voltametrică cunoscută pentru determinarea activității antioxidante totale prin modificarea relativă a curentului de electroreducere a oxigenului în intervalul de potențial de la 0,0 la -0,6 V (rel. sat. h.s.e.) pe un electrod cu peliculă de mercur (Pat. 2224997, Rusia, IPC 7 G 01 N 33/01.Metoda voltametrică pentru determinarea activității totale a antioxidanților / Korotkova E.I., Karbainov Yu.A. - Nr. 2002115232/12; cerere 06.06.2002; publ. 27.02.2004). Dezavantajul acestei metode este că apar reacții electrochimice secundare, în urma cărora eficiența determinării antioxidanților scade, ceea ce duce la o scădere a fiabilității rezultatelor.

Există o metodă cunoscută pentru monitorizarea AOA totală a agenților antioxidanti preventivi și terapeutici prin peroxidarea lipidelor la malonaldehidă cu detecție spectrofotometrică sau chemiluminiscentă (Pat. 2182706, Rusia, IPC 7 G 01 N 33/15, 33/52. Metodă de monitorizare a activitatea antioxidantă a fondurilor de antioxidanți preventivi și terapeutici / Pavlyuchenko I.I., Basov A.A., Fedosov S.R. - Nr. 2001101389/14; cerere 15.01.2001; publ. 20.05.2002). Mai mult, activitatea antioxidantă este invers proporțională cu nivelul produselor de peroxidare a lipidelor. Dezavantajul acestei metode poate fi considerat o gamă limitată de obiecte analizate, deoarece în aceste condiții se determină un singur grup de antioxidanți - lipide.

Există o metodă cunoscută pentru determinarea AOA totală a unui extract de plantă, care constă în incubarea extractului cu linetol și sulfat de fier (II), inițierea unei reacții de oxidare prin iradiere UV și interacțiunea ulterioară cu acidul tiobarbituric în prezența Triton X- 100 (Cerere 97111917/13, Rusia, IPC 6 G 01 N 33/00. Metoda de determinare a activității antioxidante totale / Rogozhin V.V. - Cerere 07/08/1997; publ. 06/10/1999). Când se efectuează spectrofotometrie, se utilizează un amestec de etanol și cloroform într-un raport de 7:3. Valoarea AOA a unui material biologic este determinată de raportul dintre acumularea produsului de reacție - malondialdehidă într-o probă care conține un extract și o probă cu un prooxidant. Dezavantajul acestei metode este posibilitatea apariției unor reacții secundare în timpul iradierii UV, ceea ce reduce fiabilitatea rezultatelor analizei obținute.

Metodele enumerate pentru determinarea AOA totală prezintă o serie de dezavantaje: intensitate ridicată a muncii, fiabilitate scăzută, valoarea măsurată a AOA totală nu este legată și nu este comparabilă cu nicio substanță general acceptată.

Cel mai apropiat analog al invenției revendicate este o metodă pentru determinarea AOA totală a plantelor medicinale prin măsurarea chemiluminiscenței care apare în timpul reacției cu luminol în prezența agentului oxidant peroxid de hidrogen (M.Kh.Navas, A.M.Khiminets, A.G.Azuero). Determinarea capacității de reducere a tincturilor de semințe de canar canaryweed prin metoda chemiluminiscenței // Journal of Analytical Chemistry. 2004. T.59. Nr. 1. P.84-86). Pentru cuantificarea AOA totală, s-a comparat capacitatea de reducere a extractului de materii prime medicinale și activitatea unui antioxidant puternic - acid ascorbic în cantitate de 25-110 μg. În comparație cu metodele enumerate, prototipul folosește peroxid de hidrogen ca agent oxidant, care interacționează cu o gamă largă de antioxidanți, iar valoarea măsurată a AOA totală a obiectului este determinată și exprimată în raport cu acidul ascorbic, care este în general un antioxidant acceptat, care face posibilă obținerea de rezultate fiabile, păstrând în același timp alte dezavantaje. Dezavantajele includ și complexitatea echipamentului utilizat în metodă.

Obiectivul tehnic al invenției revendicate este de a dezvolta o metodă mai puțin intensivă de muncă și de încredere pentru determinarea activității antioxidante totale a materialelor vegetale și a produselor alimentare pe baza acesteia.

Pentru a rezolva problema tehnică, se propune interacțiunea analitului cu reactivul 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-fenantrolină și acid ascorbic (AA) cu același reactiv, care se adaugă în raport de 1:100. , incubat cel puțin 90 de minute, fotometrul la 510±20 nm, urmat de stabilirea dependenței valorii semnalului analitic de cantitatea de substanță și calcularea valorii AOA totală. În special, calculul poate fi efectuat folosind formula (I), derivată din ecuația corespondenței cantitative dintre obiectul studiat și acidul ascorbic:

unde a, b sunt coeficienții din ecuația de regresie pentru dependența semnalului analitic de cantitatea de AC;

a", b" - coeficienți în ecuația de regresie pentru dependența semnalului analitic de cantitatea obiectului studiat;

x soare - masa agentului reducător (probă) studiată, mg.

Utilizarea reactivului propus în condițiile specificate a făcut posibilă extinderea domeniului liniar și reducerea limitei inferioare a cantităților determinate de acid ascorbic. Setul propus de caracteristici esențiale face posibilă determinarea AOA totală a unei game largi de materiale vegetale și produse alimentare pe baza acestora.

Ecuația de corespondență cantitativă conectează dependența semnalului analitic de cantitatea de acid ascorbic și dependența semnalului analitic de cantitatea obiectului de testat în condițiile unei activități antioxidante egale.

După prelucrarea rezultatelor măsurătorilor fotometrice ale mărimii semnalului analitic folosind metoda celor mai mici pătrate (K. Derffel Statistics in analytical chemistry. - M.: "Mir", 1994. P.164-169; A.K. Charykov Mathematical processing of the rezultate ale analizei chimice - L.: Chemistry, 1984. pp. 137-144) aceste dependențe au fost descrise printr-o funcție de regresie liniară: y=ax+b, unde a este coeficientul de regresie, b este termenul liber. Coeficientul a din ecuația de regresie este egal cu tangenta unghiului de înclinare a dreptei la axa x; coeficientul b - distanța de-a lungul axei y de la origine (0,0) până la primul punct (x 1, y 1).

Coeficienții a și b se calculează folosind formulele:

Ecuația de regresie pentru dependența AC de cantitatea de acid ascorbic la un moment dat are forma:

y AK = a x AK (mg) + b,

ecuația de regresie pentru dependența AC de cantitatea obiectului studiat (agent reducător):

y VOST =a" x VOST (mg)+b",

unde la AK, la VOST este densitatea optică a soluției fotometrice;

x AA (mg), x VOST (mg) - concentrația acidului ascorbic (agent reducător) în soluție;

apoi, echivalând valorile funcțiilor, obținem formula (I) pentru calcularea activității antioxidante a obiectului studiat în unități de cantitate (mg) de acid ascorbic.

Desenul arată dependența semnalului analitic de cantitatea de agent reducător.

Densitatea optică a soluțiilor analizate a fost măsurată folosind un fotoelectrocolorimetru KFK-2MP.

Se știe (F. Umland, A. Yasin, D. Tirik, G. Wünsch Compuși complexi în chimie analitică - M.: Mir, 1975. - 531 p.) că o-fenantrolina formează cu fierul un chelat solubil în apă( II) culoare roşu-portocalie, care se caracterizează printr-un maxim de absorbţie la λ=512 nm. Prin urmare, în metoda propusă, fotometria este efectuată la λ=510±20 nm.

Optimizarea compoziției reactivului și a cantității acestuia introduse în reacție s-a realizat pe baza rezultatelor planificării experimentale multifactoriale folosind metoda „pătratului latin”, care a constat în modificarea tuturor factorilor studiați în fiecare experiment și fiecare nivel. a fiecărui factor apare o singură dată cu niveluri diferite ale altor factori. Acest lucru vă permite să izolați și să evaluați separat efectul cauzat de fiecare factor studiat.

Factorii au fost: cantitatea de Fe(III), o-fenantrolină și volumul reactivului introdus în reacție. Combinația de factori ar trebui să ofere o gamă largă de liniaritate a semnalului analitic (AS) cu sensibilitate suficientă, pe de o parte, și stabilitate a reactivului în timp, pe de altă parte. Acest lucru a făcut posibilă identificarea următoarelor niveluri pentru fiecare factor:

cantitate de Fe(III): 0,003 M (A1); 0,006 M (A2); 0,009 M (A3);

cantitate de o-fenantrolină: 0,01 M (B 1); 0,02 M (B2); 0,03 M (B3);

volum de reactiv: 0,5 ml (C 1); 1,0 ml (C2); 2,0 ml (C3) (Tabelul 1).

Pentru a selecta combinația optimă de niveluri de factori, am obținut dependențe de calibrare ale AC de cantitatea de acid ascorbic în intervalul de la 10 la 150 μg (care este necesar pentru a confirma liniaritatea funcției), am calculat ecuația de regresie a dependenței obținute. , și apoi a calculat valoarea AC la o cantitate dată (120 μg) de acid ascorbic. Astfel, pentru fiecare compoziție de reactiv (factori A, B), a fost selectat volumul (factorul C) la care valoarea AC este maximă. Acest lucru ne-a permis să reducem numărul de combinații luate în considerare la nouă (Tabelul 2).

Comparând AC total pentru fiecare nivel, s-au identificat sumele cu valoarea maximă: ΣA 2 (0,991); ΣB 1 (1,066); ΣC2 (1,361). Acest lucru ne-a permis să concluzionam că compoziția optimă a reactivului este: 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-fenantrolină cu un volum introdus în reacție de 1,0 ml la 100 ml soluție.

La concentrația optimă a reactivului, am studiat modificarea dependenței AC de concentrația acidului ascorbic și a unor agenți reducători obișnuiți în obiectele naturale (tanin, rutina, quercetină) la diferiți timpi de incubare a amestecului de reacție (30, 60). , 90, 120 min). S-a constatat că pentru toți agenții reducători studiați, dependența AC de conținutul lor este liniară în intervalul 10-150 μg (vezi desen) iar valoarea AC depinde de timpul de incubare (Tabelul 3).

Din desen se poate observa că modificarea AC sub influența rutinei este nesemnificativă, taninul se apropie, iar quercetina depășește dependența similară pentru acidul ascorbic. Luând în considerare modificarea SA în funcție de timpul de incubare pentru toți agenții reducători studiați (Tabelul 3), s-a constatat că stabilizarea semnalului analitic în timp se observă de la 90 de minute.

Tabelul 3 Modificarea AC a agenților reducători în timp
Substanța de testat	m substanță, mg/cm3	Semnal analitic
Substanța de testat	m substanță, mg/cm3	Timpul de incubare al amestecului de reacție, min
30	60	90	120
Acid ascorbic	10	0,038	0,042	0,044	0,044
100	0,340	0,352	0,360	0,363
Tanin	10	0,029	0,037	0,042	0,043
100	0,280	0,295	0,303	0,308
Rutin	10	0,013	0,016	0,019	0,019
100	0,150	0,166	0,172	0,175
Quercetină	10	0,031	0,044	0,051	0,053
100	0,420	0,431	0,438	0,442

Pentru a dovedi natura sumativă a valorii AOA determinate, a fost studiat efectul reactivului Fe (III) - o-fenantrolină asupra soluțiilor model, care au inclus agenți reducători: tanin, rutina, quercetină și acid ascorbic în diferite proporții. Tabelul 4 prezintă rezultatele analizei amestecurilor model.

Tabelul 4 Rezultatele analizei amestecurilor model (P=0,95; n=3)
Numărul de componente din amestec	AOA total, calculat, pgAC	AOA total, găsit, pgAC
introdus	AOA total, calculat, pgAC	AOA total, găsit, pgAC	în ceea ce privește AK
AK	Tanin	Rutin	Quercetină	AK	Tanin	Rutin	Quercetină
-	20	20	20	-	16,77	9,56	32,73	59,06	57,08
-	10	10	10	-	8,35	4,77	16,41	29,53	26,95
-	50	10	10	-	42,02	4,77	16,41	63,20	55,04
-	10	50	10	-	8,35	23,93	16,41	48,69	50,06
-	10	10	50	-	8,35	4,77	81,70	94,82	91,61
-	30	10	10	-	25,19	4,77	16,41	46,37	39,24
-	10	30	30	-	8,35	14,35	49,06	71,76	73,47
20	20	20	20	20	16,77	9,56	32,73	79,06	96,29
50	10	10	10	50	8,35	4,77	16,41	87,95	93,07
10	50	10	10	10	42,02	4,77	16,41	73,20	78,15
10	10	50	10	10	8,35	23,93	16,41	58,69	78,74
10	10	10	50	10	8,35	4,77	81,70	104,82	121,45
30	30	10	10	30	25,19	4,77	16,41	76,37	84,59
10	10	30	30	10	8,35	14,35	49,06	81,76	103,31

Calculul valorii teoretice a AOA total a fost efectuat folosind ecuații de corespondență cantitative care caracterizează capacitatea antioxidantă a agentului reducător studiat în raport cu acidul ascorbic, în condiții de activitate antioxidantă egală: .

Valoarea AOA experimentală (găsită) a fost calculată utilizând ecuația de regresie medie pentru dependența AC de cantitatea de acid ascorbic. Din rezultatele prezentate în Tabelul 4, reiese clar că valorile AOA obţinute experimental sunt în acord satisfăcător cu cele calculate teoretic.

Astfel, valoarea AOA determinată este un indicator sumar, iar determinarea valorii sale folosind ecuații de corespondență cantitativă este corectă.

Metoda propusă a fost testată pe probe reale. Pentru a determina AOA totală a unei probe reale sau a extractului acesteia, s-au obținut dependențe de calibrare ale AC de cantitatea de analit și acid ascorbic cu un timp de incubare a amestecului de reacție de cel puțin 90 de minute. Calculul AOA total a fost efectuat conform formulei (I) și exprimat în mg de acid ascorbic per gram de obiect de testat (mgAA/g).

Pentru a confirma corectitudinea metodei propuse, aceste probe au fost testate folosind metode cunoscute, apreciind conținutul de acid ascorbic (GOST 24556-89 Produse procesate din fructe și legume. Metode de determinare a vitaminei C) și agenții reducători predominanți: taninul din ceai. (GOST 19885-74 Ceai. Metode de determinare a conținutului de tanin și cofeină), în măceșe - cantitatea de acizi organici (GOST 1994-93 Măceșe. Condiții tehnice) (Tabelul 5).

Cuvinte cheie

radical liber/antioxidant/ activitate antioxidantă / capacitatea antioxidantă totală / chemiluminiscenţă/ luminol / radical liber / antioxidant / activitate antioxidantă / capacitate antioxidantă totală / chemiluminescență / luminol

adnotare articol științific despre științe chimice, autorul lucrării științifice - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Materialele din plante medicinale sunt una dintre sursele de antioxidanți pentru organismul uman. Dintre metodele de determinare a conținutului de antioxidanți din obiectele vegetale, metoda analizei chemiluminiscenței este larg răspândită. În această lucrare s-a folosit pentru estimare capacitatea antioxidantă totală(OAE) decocturi de fructe de rowan, macese si paducel si infuzie de fructe de zmeura. Cinetica a fost înregistrată în experiment chemiluminiscenţăîntr-un sistem format din peroxidază de hrean, peroxid de hidrogen și luminol. Concentrațiile și volumul componentelor sistemului din probă au fost selectate astfel încât antioxidanții puternici (acid ascorbic) și antioxidanții moderati (quercetina) să fie complet oxidați în timpul de măsurare (10 min). Este propusă și justificată o metodă de calculare a OAE bazată pe modificări ale sumei ușoare chemiluminiscenţăîn prezenţa probelor de plante. Analiza cineticii chemiluminiscenţă au arătat că obiectele studiate au fost dominate de antioxidanți cu putere medie, inclusiv flavonoide, și antioxidanți slabi (tocoferol etc.). O comparație a valorilor OAE calculate pentru obiectele studiate și datele analizei lor chimice a arătat că produsele care conțin aceeași cantitate de antioxidanți cu rapoarte diferite în funcție de tip pot diferi în capacitatea lor de a proteja organismul de efectele nocive ale radicalilor liberi. . Tehnica descrisă este promițătoare pentru studiul obiectelor din plante care conțin un amestec de antioxidanți de diferite tipuri.

subiecte asemănătoare lucrări științifice în științe chimice, autorul lucrării științifice - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

2016 / Georgiy Vladimirov, Sergunova E.V., Izmaylov D.Yu., Vladimirov Yu.A.
Determinarea antioxidanților prin chemiluminiscență activată folosind 2,2"-azo-bis(2-amidinopropan)
2012 / Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Efectul antioxidant al dihidroquercetinei și rutinei în reacțiile peroxidazei catalizate de citocromul c
2008 / Demin E.M., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Evaluarea capacității oxidative și antioxidante a substraturilor biologice prin chemiluminiscență indusă de reacția Fenton
2016 / Piskarev Igor Mihailovici, I.P. Ivanova
Determinarea conținutului de lipohidroperoxizi din lipoproteinele serice folosind sistemul microperoxidază-luminol
2011 / Teselkin Yuri Olegovich, Babenkova Irina Vladimirovna
Metode de cercetare a antioxidantilor
2004 / Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Maltseva E.V.
Activitatea antioxidantă a plantelor utilizate în etnomedicina din Tuva
2012 / Chekhani N.R., Teselkin Yu.O., Pavlova L.A., Kozin S.V., Lyubitsky O.B.
Studiul proprietăților antioxidante ale Fosprenilului în diferite sisteme de testare biologică
2017 / A. V. Sanin, A. N. Narovlyansky, A. V. Pronin, T. N. Kozhevnikova, V. Yu. Sanina, A. D. Agafonova
Influența diferitelor doze de bifenili policlorurați asupra stării de chemiluminiscență spontană și indusă de imunoglobuline dependentă de luminol a sângelui integral
2016 / Gabdulkhakova I.R., Kayumova A.F., Samokhodova O.V.
Evaluarea sistemului de peroxidare a lipidelor de protecție antioxidantă la copiii cu hipertensiune arterială esențială folosind metode de spectrofotometrie și chemiluminiscență
2014 / Natyaganova Larisa Viktorovna, Gavrilova Oksana Aleksandrovna, Kolesnikova Larisa Romanovna

Determinarea chimioluminiscentă a capacității antioxidante totale în materialul vegetal medicinal

Materialul vegetal medicinal este una dintre sursele de antioxidanți pentru organismul uman. Analiza chemiluminiscenței este una dintre metodele comune de determinare a conținutului de antioxidanți din materialele vegetale. În lucrarea noastră, analiza chemiluminiscenței a fost utilizată pentru a determina capacitatea antioxidantă totală (TAC) a decocturilor de fructe de frasin de munte, trandafir și păducel, precum și a infuziei de fructe de zmeură. Experimentele au stabilit cinetica chemiluminiscenței unui sistem format din peroxidază de hrean, peroxid de hidrogen și luminol. Concentrațiile și volumele componentelor sistemului au fost alese astfel încât antioxidanții puternici (acid ascorbic) și antioxidanții de forță medie (quercetina) să fie complet oxidați în timpul măsurării (10 minute). A fost propusă și fundamentată o metodă pentru calculul TAC bazată pe modificări ale sumei luminii chemiluminiscenței în prezența mostrelor de plante. Analiza cineticii chemiluminiscenței a arătat că antioxidanții de forță medie domină în obiectele studiate, inclusiv flavonoide și antioxidanți slabi (tocoferol și alții). Compararea valorilor TAC calculate pentru obiectele studiate și datele lor de analiză chimică a arătat că produsele care conțin aceeași cantitate de antioxidanți cu proporții diferite de antioxidanți în funcție de tipuri pot varia în capacitatea lor de a proteja organismul împotriva efectelor nocive ale radicalilor liberi. . Tehnica descrisă este una promițătoare pentru studiul obiectelor din plante care conțin un amestec de diferite tipuri de antioxidanți.

Textul lucrării științifice pe tema „Metoda chemiluminiscentă pentru determinarea capacității antioxidante totale în materialele vegetale medicinale”

metoda chemiluminiscenta pentru determinarea capacitatii antioxidante totale in materialele vegetale medicinale

G. K. Vladimirov1^, E. V. Sergunova2, D. Yu. Izmailov1, Yu. A. Vladimirov1

1Departamentul de Biofizică Medicală, Facultatea de Medicină Fundamentală, Universitatea de Stat M.V. Lomonosov Moscova, Moscova

2 Departamentul de Farmacognozie, Facultatea de Farmacie,

Prima Universitate Medicală de Stat din Moscova numită după I.M. Sechenov, Moscova

Materialele din plante medicinale sunt una dintre sursele de antioxidanți pentru organismul uman. Dintre metodele de determinare a conținutului de antioxidanți din obiectele vegetale, metoda analizei chemiluminiscenței este larg răspândită. În această lucrare, s-a folosit pentru a evalua capacitatea antioxidantă totală (TAC) a decocturilor de fructe de rowan, măceș și păducel și a infuziei de fructe de zmeură. În experiment, cinetica chemiluminiscenței a fost înregistrată într-un sistem format din peroxidază de hrean, peroxid de hidrogen și luminol. Concentrațiile și volumul componentelor sistemului din probă au fost selectate astfel încât antioxidanții puternici (acid ascorbic) și antioxidanții moderati (quercetina) să fie complet oxidați în timpul de măsurare (10 min). A fost propusă și justificată o metodă pentru calcularea OAE bazată pe modificări ale sumei luminoase a chemiluminiscenței în prezența mostrelor de plante. Analiza cineticii chemiluminiscenței a arătat că în obiectele studiate predomină antioxidanții cu putere medie, inclusiv flavonoidele, și antioxidanții slabi (tocoferol etc.). O comparație a valorilor OAE calculate pentru obiectele studiate și datele analizei lor chimice a arătat că produsele care conțin aceeași cantitate de antioxidanți cu rapoarte diferite în funcție de tip pot diferi în capacitatea lor de a proteja organismul de efectele nocive ale radicalilor liberi. . Tehnica descrisă este promițătoare pentru studiul obiectelor din plante care conțin un amestec de antioxidanți de diferite tipuri.

Cuvinte cheie: radical liber, antioxidant, activitate antioxidantă, capacitate antioxidantă totală, chemiluminiscență, luminol

Finanțare: lucrarea a fost susținută de Fundația Rusă pentru Știință, grant nr. 14-15-00375.

Ex3 Pentru corespondență: Georgy Konstantinovici Vladimirov

119192, Moscova, Lomonosovsky pr-t, 31, clădirea 5; [email protected]

Articol primit: 10.03.2016 Articolul acceptat spre publicare: 18.03.2016

determinarea chimioluminiscentă a capacităţii antioxidante totale în materialul vegetal medicinal

1 Departamentul de Biofizică Medicală, Facultatea de Medicină Fundamentală, Universitatea de Stat din Moscova Lomonosov, Moscova, Rusia

2 Departamentul de Farmacognozie, Facultatea de Farmacie,

Prima Universitate Medicală de Stat Sechenov Moscova, Moscova, Rusia

Cuvinte cheie: radical liber, antioxidant, activitate antioxidantă, capacitate antioxidantă totală, chemiluminiscență, luminol

Finanțare: această lucrare a fost susținută de Fundația Rusă pentru Știință, grant nr. 14-15-00375.

Mulțumiri: autorii îi mulțumesc lui Andrey Alekseev de la Universitatea de Stat Lomonosov din Moscova pentru asistența acordată în realizarea experimentului. Corespondența trebuie adresată: Georgiy Vladimirov

Lomonosovskiy Prospekt, d. 31, k. 5, Moscova, Rusia, 119192; ur [email protected] Primit: 10.03.2016 Acceptat: 18.03.2016

Radicalii liberi formați în organism perturbă structura membranelor celulare, ceea ce, la rândul său, duce la dezvoltarea diferitelor stări patologice. Efectele oxidative distructive ale radicalilor sunt prevenite de sistemul de apărare antioxidant al organismului, în care compușii cu greutate moleculară mică - interceptori de radicali (capcane) - joacă un rol important. Una dintre sursele de antioxidanți sunt materialele din plante medicinale, precum și medicamentele pe bază de acestea, studiul potențialului antioxidant al cărora ajută la creșterea efectului lor preventiv și terapeutic.

Principalele metode de determinare a antioxidanților sunt discutate în lucrări, cu toate acestea, definiția antioxidanților ca compuși chimici nu oferă o imagine completă a proprietăților de protecție ale obiectului studiat: acestea sunt determinate nu numai de cantitatea unui anumit antioxidant, dar şi prin activitatea fiecăruia dintre ei. Activitatea antioxidantă sau activitatea antioxidantă, AOA, este constanta de viteză a reacției unui antioxidant cu un radical liber (kInH). Metoda chemiluminiscenței (CL) face posibilă determinarea cantității totale de radicali care leagă antioxidanții într-o probă (capacitate antioxidantă totală, TCA), iar atunci când se utilizează metoda de modelare matematică a cineticii CL, de asemenea, viteza de formare și reacție a radicali cu antioxidanți, adică AOA.

Cea mai comună modificare a metodei chemiluminiscenței pentru determinarea capacității antioxidante totale se bazează pe utilizarea luminolului ca activator al chemiluminiscenței. O probă cu adaos de luminol, peroxid de hidrogen și un compus capabil să formeze radicali ca urmare a descompunerii spontane (termoliza), de exemplu 2,2"-azobis-(2-amidinopropan) diclorhidrat (ABAP):

În prezența oxigenului molecular, radicalul alchil R^ formează radicalul peroxil ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv Din LH, prin formarea unor substanțe intermediare (hidroperoxid de luminol și endoperoxid de luminol), se formează o moleculă din produsul final al oxidării luminolului, acidul aminoftalic, în stare excitată electronic, care emite un foton. , iar ca rezultat se observă chemiluminiscenţă . Intensitatea CL este proporțională cu rata producției de fotoni și, la rândul său, este proporțională cu concentrația staționară de LH în sistem. Prin interacțiunea cu radicalii, antioxidanții întrerup lanțul de transformări descris și previn formarea unui foton.

Compușii susceptibili la termoliză nu sunt singura sursă posibilă de radicali atunci când se analizează capacitatea antioxidantă a unei probe prin metoda chemiluminiscentă. Alternativele sunt peroxidază de hrean-peroxid de hidrogen, hemin-peroxid de hidrogen, citocrom c-cardiolipin-peroxid de hidrogen etc. Schema de reacție pentru oxidarea luminolului de către peroxidaze este discutată în lucrarea lui Cormier și colab. .

Curbele cinetice CL pentru aceste sisteme reflectă două etape ale reacției: stadiul de creștere a intensității CL și stadiul unui platou sau scădere treptată a luminiscenței, când

Intensitatea CL este fie constantă, fie scade lent. Lucrarea descrie două abordări pentru măsurarea capacității antioxidante totale care iau în considerare această caracteristică a curbelor. Metoda TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) se bazează pe măsurarea perioadei de latentă a CL t și poate fi utilizată pentru determinarea antioxidanților precum Trolox sau acidul ascorbic: se caracterizează printr-o constantă mare a vitezei de reacție cu radicalii și din acest motiv pot fi numiti antioxidanti puternici. În perioada de latentă are loc oxidarea lor completă. Metoda TAR (Total Antioxidant Reactivity) este utilizată pentru a măsura gradul de stingere a chemiluminiscenței q la platoul sau maximul curbei de chimioluminiscență:

unde I este intensitatea chemiluminiscenței fără un antioxidant și 11 este intensitatea CL în prezența unui antioxidant. Această metodă este utilizată dacă sistemul conține predominant antioxidanți slabi cu constante de interacțiune cu rată scăzută cu radicalii - mult mai scăzută în comparație cu constanta luminolului.

Efectul antioxidanților este caracterizat nu numai de indicatorii t și c. După cum se poate observa din lucrări, efectul antioxidanților precum acidul uric în sistemul hemin-H2O2-luminol sau tocoferol, rutina și quercetina în sistemul citocrom c-cardiolipin-H2O2-luminol se caracterizează printr-o modificare a ratei maxime. de creștere a CL (utx). După cum arată rezultatele modelării matematice a cineticii, valorile constantelor vitezei de interacțiune a acestor antioxidanți cu radicalii sunt apropiate de valoarea constantei luminolului, prin urmare, astfel de antioxidanți pot fi numiți antioxidanți de rezistență medie.

Dacă materialul studiat, în special materiile prime vegetale, conținea un singur tip de antioxidanți, atunci conținutul acestora ar putea fi caracterizat prin unul dintre cei trei indicatori enumerați mai sus (t, c sau V). Dar materialele vegetale conțin un amestec de antioxidanți de diferite puteri. Pentru a rezolva această problemă, unii autori au folosit modificarea sumei luminii a chemiluminiscenței într-un anumit timp DE, calculată prin formula

DE = DE0 - DE,

unde DE0 și DE5 sunt sumele luminii CL pentru un timp dat? în probele de control, respectiv de testare. Timpul trebuie să fie suficient pentru oxidarea tuturor antioxidanților din sistem, adică pentru ca curba CL a probei de testat să atingă nivelul curbei CL a probei martor. Acesta din urmă presupune că cercetătorii nu trebuie doar să înregistreze suma luminii a strălucirii, ci și să înregistreze curba cinetică CL pentru un timp suficient de lung, ceea ce nu se face întotdeauna.

Deoarece toți parametrii măsurați depind de dispozitiv și de condițiile de măsurare, efectul antioxidant al substanței din sistemul studiat este de obicei comparat cu efectul unui antioxidant standard, de exemplu Trolox.

Sistemul peroxidază de hrean-peroxid de hidrogen a fost utilizat pentru analiza capacității antioxidante totale a materialelor vegetale de mulți autori. Pentru estimarea cantității de antioxidanți din probe, s-a folosit perioada latentă a CL (metoda TRAP), iar aria de sub curba de dezvoltare CL a fost utilizată în lucrări. Cu toate acestea, lucrările enumerate nu oferă o justificare clară

alegerea unuia sau altuia parametru pentru evaluarea OAU.

Scopul studiului a fost de a determina modul în care raportul dintre diferitele tipuri de antioxidanți afectează TOA și de a modifica metoda chemiluminiscenței astfel încât să se poată determina mai precis TOA în materialele vegetale. Pentru a face acest lucru, ne stabilim mai multe sarcini. Mai întâi, comparați cinetica CL a obiectelor studiate cu cinetica antioxidanților standard de trei tipuri (puternici, medii și slabi) pentru a înțelege ce tip de antioxidanți au contribuția principală la OAU a obiectelor studiate. În al doilea rând, se calculează OAE al obiectelor studiate prin măsurarea scăderii sumei luminii CL sub influența acestor obiecte în comparație cu efectul antioxidantului care oferă cea mai mare contribuție la OAE.

MATERIALE ȘI METODE

Obiectele studiului au fost mostre industriale de păducel, rowan și măceș produse de JSC Krasnogorskleksredstva (Rusia), precum și fructe de zmeură colectate de autori în regiunea Moscovei în condiții naturale de creștere și uscate la o temperatură de 60-80 °. C până când au încetat să mai elibereze suc și să se deformeze la apăsare.

Reactivii pentru analiza capacitatii antioxidante prin metoda chemiluminiscenta au fost: KH2PO4, solutie tampon 20 mM (pH 7,4); peroxidază din rădăcini de hrean (activitate 112 unități/mg, M = 44.173,9), soluție apoasă 1 mM; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindionă, hidrazida acidului 3-aminoftalic, M = 177,11), soluţie apoasă 1 mM; peroxid de hidrogen (H2O2, M = 34,01), soluție apoasă 1 mM; soluții de antioxidanți (acid ascorbic, quercetină, tocoferol). Toți reactivii sunt fabricați de Sigma Aldrich (SUA).

Decocturile de fructe de păducel, rowan și măceș și o infuzie de fructe de zmeură au fost preparate conform metodelor Farmacopeei de Stat a URSS, prevăzute în articolul de farmacopee generală „Infuzii și decocturi”.

Determinarea capacității antioxidante totale a fost efectuată prin înregistrarea chemiluminiscenței pe un chemiluminometru Lum-100 (DISoft, Rusia) folosind software-ul PowerGraph 3.3. Pentru a determina OAE în materiale vegetale, 40 μl de luminol la o concentrație de 1 mM, 40 μl de peroxidază de hrean la o concentrație de 0,1 μM, de la 10 la 50 μl de decoct sau infuzie (în funcție de concentrație) și tampon fosfat în cantitatea necesară au fost plasate în cuva aparatului.pentru a aduce volumul total de probă la 1 ml. Cuva a fost instalată în aparat și a fost înregistrat CL, observând semnalul de fundal. După 48 s de înregistrare a semnalului de fundal, în cuvă s-au adăugat 100 μl de H2O2 la o concentrație de 1 mM și înregistrarea CL a fost continuată timp de 10 minute. Au fost preparate patru probe cu concentrații diferite ale fiecărui obiect vegetal. CL a fost, de asemenea, înregistrată pentru soluții de acid ascorbic, quercetină și tocoferol la cinci concentrații diferite pentru fiecare dintre antioxidanți. Ulterior, OAU a probelor de decocturi și infuzii a fost recalculată la quercetină.

a atins un platou, indicând distrugerea completă a antioxidanților din sistem. Diluțiile probelor studiate și concentrațiile de soluții de antioxidanți standard (indicate în legendele figurilor) au fost selectate în așa fel încât toate curbele cinetice CL au fost măsurate la aceeași sensibilitate a dispozitivului.

Capacitatea antioxidantă a fost calculată din modificarea ariei (AS) sub curba cinetică a chemiluminiscenței (suma luminii) la adăugarea unei substanțe care conține un antioxidant. Pentru a face acest lucru, am calculat S0 pentru un sistem fără antioxidant și am scăzut din acesta aria SS, care caracterizează sistemul la care a fost adăugat antioxidantul. Valoarea AS depinde de sensibilitatea chemiluminometrului și de condițiile de măsurare. Raportul AS/C ■ V (unde C este concentrația materialului biologic studiat în cuvă, g/l, iar V este volumul cuvei, l) exprimă capacitatea antioxidantă a 1 g din materialul studiat, adică materii prime vegetale.

Într-un mod similar, am calculat capacitatea antioxidantă ASa a unei soluții de antioxidant standard, de exemplu, quercetina, plasată în același volum al amestecului de reacție. Raportul AS/CÄ ■ V (unde CA este concentraţia în greutate a antioxidantului din cuvă, g/l) exprimă capacitatea antioxidantă a 1 g de antioxidant.

Pentru fiecare dintre antioxidanții standard, semnalul din soluții de mai multe concentrații a fost înregistrat pentru a se asigura că calculele au fost într-o relație liniară și rezultatele obținute sunt reproductibile. Într-adevăr, s-a obținut o dependență liniară (ASa = kA ■ CA) a semnalului de concentrație, din care s-a calculat coeficientul stoichiometric kA. Conform criteriului Fisher, valorile kA obținute pentru antioxidanții standard sunt semnificative statistic cu o probabilitate de 0,975. În continuare, semnalul de la patru concentrații a fost înregistrat pentru fiecare dintre cele patru probe de plante, iar pentru toate probele s-a obținut o dependență liniară a semnalului de concentrație (AS = k ■ C), din care s-a calculat coeficientul stoichiometric k. Cu o probabilitate de 0,975 (testul lui Fisher), valorile k obținute pentru probele de plante sunt semnificative statistic. Capacitatea antioxidantă totală a materialului vegetal în ceea ce privește masa antioxidantului standard (mg%) a fost găsită folosind formula

OAE = k ■ 105. k

Valorile au fost prezentate ca medie aritmetică ± abatere standard (M ± 5) la p<0,05.

REZULTATE CERCETĂRI

Un studiu al cineticii chemiluminiscenței în prezența ascorbatului de sodiu (Fig. 1) a arătat că acest antioxidant se caracterizează printr-o perioadă latentă când CL este aproape complet suprimată. Durata sa este proporțională cu cantitatea de antioxidant din sistem. În acest caz, nici panta curbelor CL și nici intensitatea CL pe platou nu se modifică. Acest lucru se explică prin faptul că acidul ascorbic este un antioxidant puternic care interceptează toți radicalii formați în sistem, inclusiv radicalii luminol, iar CL nu se dezvoltă până când tot ascorbatul nu este oxidat.

Efectul tocoferolului (Fig. 2) s-a manifestat printr-o scădere a intensității CL pe platou, care este tipică pentru antioxidanții slabi, deși tocoferolul este considerat unul dintre cei mai

antioxidanti puternici. Poate că această discrepanță se datorează faptului că, în experimentul nostru, radicalii liberi au fost într-o soluție apoasă, în timp ce efectul tocoferolului este de obicei studiat în medii nepolare. Într-un studiu în care sursa de radicali a fost un complex de citocrom c cu cardiolipină și reacția cu luminol a avut loc în cadrul acestui complex, tocoferolul a avut proprietățile unui antioxidant de putere medie.

După ce am studiat efectul diferitelor concentrații de quercetină asupra sistemului nostru (Fig. 3) și comparând curbele cinetice pentru acesta și ascorbat de sodiu și tocoferol, se poate observa că principalul efect al quercetinei se manifestă printr-o modificare a pantei curbe, adică rata de dezvoltare a CL, care este tipică pentru antioxidanții cu putere medie.

Curbele CL pentru toate decocturile studiate (Fig. 4) seamănă cu curbele pentru quercetină cu o uşoară scădere a intensităţii CL la final, adică la atingere

Timp, min

Orez. 1. Efectul ascorbatului de sodiu asupra cineticii chemiluminiscenței

Concentrațiile componentelor sistemului: luminol - 40 µM, peroxidază de hrean - 4 nM, peroxid de hidrogen - 100 µM. Curbe: 1 - proba martor; 2 - 0,05 uM; 3 - 0,10 uM; 4 - 0,15 uM; 5 - 0,2 uM; 6 - 0,25 pM ascorbat de sodiu.

platou. După cum se arată în lucrare, acest comportament este tipic pentru antioxidanții cu putere medie, care în cazul nostru includ polifenoli - flavonoide și taninuri. Pentru infuzia de fructe de zmeură (Fig. 4, D), există o scădere vizibilă a chemiluminiscenței la nivelul platoului, care este tipică pentru antioxidanții slabi, cum ar fi tocoferolul în acest caz. În ceea ce privește quercetină și tocoferol, infuzia de zmeură conține 4,7 ± 0,9 µmol/g quercetină și 11,9 ± 0,8 µmol/g tocoferol.

La compararea curbelor de chemiluminiscență obținute pentru diferite concentrații ale celor patru extracte apoase studiate din materiale vegetale, s-a demonstrat că contribuția antioxidanților medii și slabi la capacitatea antioxidantă totală a probelor a scăzut în următoarele serii: infuzie de fructe de zmeură (Fig. 4). , D), decoct de măceș (Fig. 4, B), decoct de fructe de rowan (Fig. 4, A), decoct de fructe de păducel (Fig. 4, B). Valorile AS bazate pe concentrația C a substanței studiate în cuvă și valorile capacității totale antioxidante în termeni de quercetină sunt date în tabel.

DISCUȚIA REZULTATELOR

Datele obținute în timpul experimentelor și valorile OAE ale obiectelor studiate calculate pe baza acestora au fost comparate cu conținutul principalilor antioxidanți din acestea, determinate prin metode chimice de analiză. În ciuda faptului că corelația pozitivă dintre cantitatea totală de antioxidanți și TAU din diferite obiecte este incontestabilă, există încă diferențe vizibile între acești indicatori. De exemplu, dacă luăm suma conținutului de flavonoide, taninuri și acid ascorbic, atunci se dovedește a fi mai mare decât TAU calculată pentru toate obiectele studiate, cu excepția decoctului de fructe de păducel (tabel).

Alți cercetători au arătat, de asemenea, că rezultatele analizei chimice și valoarea TAU determinată prin metoda chemiluminiscentă adesea nu coincid. În funcționare, capacitatea totală antioxidantă, determinată

46 Timp, min

eu" "h chi----.

Orez. 2. Efectul tocoferolului asupra cineticii chemiluminiscenței

Concentrațiile componentelor sistemului: luminol - 40 µM, peroxidază de hrean - 4 nM, peroxid de hidrogen - 100 µM. Curbe: 1 - proba martor; 2 - 0,01 uM; 3 - 0,025 uM; 4 - 0,06 uM; 5 - 0,1 uM; 6 - 0,2 uM tocoferol.

46 Timp, min

Orez. 3. Efectul quercetinei asupra cineticii chemiluminiscenței Concentrațiile componentelor sistemului: luminol - 40 µM, peroxidază de hrean - 4 nM, peroxid de hidrogen - 100 µM. Curbe: 1 - proba martor; 2 - 0,02 uM; 3 - 0,03 uM; 4 - 0,04 uM; 5 - 0,05 uM; 6 - 0,06 uM quercetină.

Timp, min

46 Timp, min

120 I 100 80\60 40 20

46 Timp, min

Orez. 4. Efectul decocturilor de fructe de rowan (A), păducel (B), măceș (C) și infuziei de fructe de zmeură (D) asupra cineticii chemiluminiscenței Concentrațiile componentelor sistemului: luminol - 40 µM, peroxidază de hrean - 4 nM, peroxid de hidrogen - 100 uM. (A) Curbe: 1 - proba martor; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g/l decoct de fructe de rowan. (B) Curbe: 1 - proba martor; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l decoct din fructe de păducel. (B) Curbe: 1 - proba martor; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l decoct de măceș. (D) Curbe: 1 - proba martor; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l infuzie de fructe de zmeura.

în sistemul peroxidază-luminol-peroxid de hidrogen corelat cu conţinutul de compuşi triterpenici. Totuși, în lucrările acelorași autori, în care obiectul de studiu a fost o altă plantă, aceștia nu au observat o corelație a OAE cu conținutul niciunui grup de substanțe, inclusiv flavonoide.

Astfel de discrepanțe sunt asociate cu cel puțin trei factori. În primul rând, activitatea antioxidanților este importantă, adică rata de interacțiune a acestora cu radicalii, care este diferită pentru diferiții antioxidanți incluși în proba de plantă. Potrivit lui Izmailov, constantele de viteză ale reacțiilor corespunzătoare pentru mexidol, tocoferol și quercetină se corelează ca 0,04: 2: 60. În al doilea rând, fiecare moleculă antioxidantă, care intră într-o reacție chimică, poate intercepta un număr diferit de radicali. Conform lucrării, quercetina, acizii uric și ascorbic au interceptat 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 și, respectiv, 0,5 ± 0,2 radicali per moleculă antioxidantă reacționată (a fost folosit sistemul hemin-H202-luminol). În al treilea rând, rezultatele studiului ar putea fi influențate de prezența activității peroxidazei în probele de plante în sine, ca și în lucrare, precum și de prezența calciului în probe, care, așa cum se arată în lucrare, este capabil să crească. activitatea peroxidazei de hrean în anumite condiţii. Acest lucru duce de obicei la mai mult

intensitate CL mai mare pe platou decat pe curbele de control, ceea ce noi insa nu am observat.

Primul factor limitează drastic utilizarea unui astfel de parametru ca modificare a sumei luminii, deoarece timpul de măsurare a chimioluminiscenței trebuie să fie mai mare decât timpul pentru consumul tuturor antioxidanților din proba de testat. Apariția acestui moment poate fi judecată doar prin măsurarea cineticii chemiluminiscenței. În plus, contribuția antioxidanților slabi la OAU este puternic subestimată, deoarece timpul pentru oxidarea lor completă este de multe ori mai mare decât durata de măsurare acceptabilă (10-20 min).

Coeficientul stoichiometric al antioxidantului este și mai important. Numărul de radicali n interceptați de acesta este egal cu

unde p este coeficientul stoichiometric, iar Am este modificarea concentrației antioxidantului în timpul de măsurare, în cazul nostru, concentrația inițială a substanței de testat din proba de testat.

Diferența de suma luminoasă a luminiscenței în absența antioxidantului și în prezența acestuia este proporțională cu n. Numărul total de radicali interceptați este egal cu n = Y.p. m,

unde este coeficientul stoechiometric al unui anumit antioxidant și m este concentrația acestuia în timpul măsurării

Obiectul de studiu Flavonoide, mg%* Taninuri, mg%* Acid ascorbic, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. unitati TAU, mg% quercetină

Decoctul de fructe de rowan 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Decoctul de măceș 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Decoctul de fructe de păducel 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Infuzie de fructe uscate de zmeură 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Notă: * - date din literatură, . AS - modificarea sumei de lumină pentru probă, rel. unități, C - concentrația probei în cuvă, g/l. Valorile calculate sunt de încredere la p<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

Rhenia. Numărul total de radicali interceptați cu siguranță nu este egal cu cantitatea totală de antioxidanți, deoarece coeficienții pt nu numai că nu sunt egali cu unitatea, dar diferă semnificativ și pentru diferiți antioxidanți.

Valoarea lui n este proporțională cu diferența de sume luminoase măsurate într-un anumit timp între o probă care conține un antioxidant și o probă de control care nu conține antioxidanți:

unde k este un coeficient care este constant în aceleași condiții de măsurare.

Metoda discutată în articol ne permite să determinăm capacitatea antioxidantă totală, în timp ce analiza chimică ne permite să determinăm conținutul total de antioxidanți din produs. Prin urmare, metoda chemiluminiscenței pare a fi mai informativă decât analizele chimice.

Am selectat condițiile de evaluare a capacității antioxidante totale a materiilor prime vegetale prin înregistrarea cineticii chemiluminiscenței într-un sistem format din peroxidază de hrean, peroxid de hidrogen și luminol (concentrații componente - 4 nM, 100 µM și respectiv 40 µM; fosfat 20 mM). tampon, pH 7,4),

a asigurat oxidarea antioxidantilor puternici (acid ascorbic) si a antioxidantilor cu putere medie (quercetina) in 10 minute. Această durată de măsurare este convenabilă și asigură calitatea necesară a măsurării.

Analiza cineticii chemiluminiscenței a arătat că în obiectele studiate (decocturi de fructe de rowan, măceșe, păducel și infuzie de fructe de zmeură) principalii antioxidanți sunt antioxidanții de putere medie, inclusiv flavonoide, și putere slabă (tocoferol etc.). Pe baza scăderii sumei luminii chemiluminiscenței, a fost calculată capacitatea totală antioxidantă pentru obiectele studiate. Compararea valorilor TAU obținute cu rezultatele analizei chimice a arătat că produsele care conțin aceeași cantitate de antioxidanți cu rapoarte diferite pot diferi în capacitatea lor de a proteja eficient organismul de efectele nocive ale radicalilor liberi. Tehnica descrisă este promițătoare pentru studiul obiectelor din plante care conțin un amestec de diverși antioxidanți. În același timp, se caracterizează prin simplitate și costul scăzut al cercetării. Combinația de măsurare a cineticii chemiluminiscenței cu modelarea matematică a reacțiilor nu numai că va automatiza procesul de determinare a TAU, dar va determina și contribuția grupurilor individuale de antioxidanți la indicator.

Literatură

1. Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. A. Radicalii liberi ca participanți la procesele de reglementare și patologice. În: Grigoriev A.I., Vladimirov Yu.A., editori. Științe de bază – medicină. Biophys. Miere. tehn. M.: MAX Press; 2015. vol. 1. p. 38-71.

3. Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Maltseva E.V. Metode pentru studierea antioxidanților. Chim. rast. materii prime. 2004; (3): 63-75.

4. Vasiliev R. F., Kancheva V. D., Fedorova G. F., Butovska D. I., Trofimov A. V. Activitatea antioxidantă a chalconelor. Determinarea chemiluminiscentă a reactivității și calculul chimic cuantic al energiilor și structurilor reactivilor și intermediarilor. Cinetică și cataliză. 2010; 51 (4): 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil"ev RF, Veprintsev TL. Peroxi-

chemiluminiscența mediată de radicali: diversitatea mecanică și elementele fundamentale pentru analiza antioxidantă. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Evaluarea capacității antiradicale prin chemiluminiscența luminolului indusă de H2O2-hemină. J Agric Food Chim. 3 decembrie 2003; 51 (25): 7481-8.

9. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V. Radicalii liberi și chemiluminiscența celulară. Uspekhi biol. chimic. 2009; 49: 341-88.

10. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V., Izmailov D. Yu. Chemiluminiscența cinetică ca metodă de studiere a reacțiilor radicalilor liberi. Biofizică. 2011; 56 (6): 1081-90.

11. Izmailov D. Yu., Demin E. M., Vladimirov Yu. A. Determinarea activității antioxidante prin măsurarea cineticii chemiluminiscenței. Fotobiologie și fotomedicină. 2011; 7 (2): 70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminescența luminolului indusă de termoliză 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropan). Liber

Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Despre utilizarea stingerii luminiscenței luminolului pentru a evalua activitatea SOD. Free Radic Biol Med. iunie 1994; 16 (6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Evaluarea potențialului antioxidant total (TRAP) și a reactivității antioxidante totale din măsurătorile chemiluminiscenței îmbunătățite cu luminol. Free Radic Biol Med. 1995 februarie; 18 (2): 153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. O investigație a mecanismului peroxidării luminiscente a luminolului prin tehnici de curgere oprită. J Biol Chem. 25 septembrie 1968; 243 (18): 4706-14.

21. Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A. Determinarea antioxidanților prin chemiluminiscență activată folosind 2,2"-azo-bis(2-amidinopropan). Vestn. MGU. Ser. 2. Chem 2012;53(3): 187-93.

24. Ministerul Sănătăţii al URSS Farmacopeea de Stat al URSS ed. XI. Vol. 2 „Metode generale de analiză. Materii prime plante medicinale.” M.: Medicină; 1987. p. 147-8.

25. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Kornyushina M. A. Studiul preparatelor de extracție a măceșului. Farmacie. 2012; (2): 14-6.

26. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Avrach A. S. Studiul fructelor de păducel folosind diverse metode de conservare și extracție apoasă. Farmacie. 2010; (5): 16-8.

27. Avrach A. S., Sergunova E. V., Kuksova Ya. V. Substanțe biologic active din fructe și extracte apoase de zmeură comună. Farmacie. 2014; (1): 8-10.

28. Avrach A. S., Samylina I. A., Sergunova E. V. Studiul substanțelor biologic active ale fructelor de păducel - materii prime pentru prepararea tincturilor de matrice homeopată. La sat. științific tr. pe baza materialelor de la XXIV Moscova. internaţional homeopat. conf. „Dezvoltarea metodei homeopate în medicina modernă”; 24-25 ianuarie 2014; Moscova. M.; 2014. p. 146-7.

29. Sergunova E. V., Sorokina A. A. Studiul compoziției substanțelor biologic active din materiile prime din plante medicinale ale diferitelor metode de conservare. La sat. teze bazate pe materiale din XX Ross. naţional congr. „Omul și medicina”; 15-19 aprilie 2013; Moscova. M.: EKOOnis; 2013. p. 184-90.

30. Aleksandrova E. Yu., Orlova M. A., Neiman P. L. Studiul activității peroxidazei în extractele din rizomi și rădăcini de hrean și stabilitatea acesteia la diferite influențe. Vestn. Universitatea de Stat din Moscova. Ser. 2. Chim. 2006; 47 (5): 350-2.

1. Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Svobodnye radikaly kak uchastniki regulyatornykh și patologicheskikh protsessov. În: Grigor"ev AI, Vladimirov YuA, editori. Fundamental"nye nauki - medicitsine. Biofizicheskie meditsinskie tekhnologii. Moscova: MAKS Press; 2015.v. 1. p. 38-71. Rusă.

2. Chanda S, Dave R. Modele in vitro pentru evaluarea activității antioxidante și unele plante medicinale care posedă proprietăți antioxidante: O prezentare generală. Afr J Microbiol Res. 2009 decembrie; 3 (13): 981-96.

3. Khasanov VV, Ryzhova GL, Mal"tseva EV. Metody issledovaniya antioksidantov. Khimija Rastitel"nogo Syr"ja. 2004; (3): 63-75. Rusă.

4. Vasil"ev RF, K""ncheva VD, Fedorova GF, B""tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" khalkonov. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reaktsionnoi sposobnosti i cantitatevo-khimicheskii raschet energii i stroeniya reagentov i intermediatov. Cinetică și cataliză. 2010; 51 (4): 533-41. Rusă.

5. Slavova-Kazakova AK, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA, et al. Potențialul antioxidant al compușilor legați de curcumină studiat prin cinetica chemiluminiscenței, eficiența de rupere a lanțului, activitatea de captare (ORAC) și calculele DFT. Beilstein J Org Chem. 11 august 2015; 11: 1398-411.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil"ev RF, Veprintsev TL. Peroxy-radical-mediated chemiluminescence: mechanistic diversity and fundamentals for antioxidant assay. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasil"ev RF. Facile chemiluminescence assay for antioxidative properties of vegetal lipides: fundamentals and illustrative examples. Analyst. 2009 Oct; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Evaluarea capacității antiradicale de către luminolul indus de H2O2-hemină

9. Vladimirov YuA, Proskurnina EV. Svobodnye radikaly i kletochnaya khemilyuminestsentsiya. Usp Biol Khim. 2009; 49: 341-88. Rusă.

10. Vladimirov YuA, Proskurnina EV, Izmailov DYu. Kineticheskaya khemilyuminestsentsiya kak metod izucheniya reaktsii svobodnykh radikalov. Biofizică. 2011; 56 (6): 1081-90. Rusă.

11. Izmailov DYu, Demin EM, Vladimirov YuA. Opredelenie aktivnosti antioksidantov metodom izmereniya kinetiki khemilyuminestsen-tsii. Fotobiologie și fotomeditsina. 2011; 7 (2): 70-6. Rusă.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminescența luminolului indusă prin termoliză 2,2"-azo-bis(2-amidinopropan). Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Despre utilizarea stingerii luminiscenței luminolului pentru a evalua activitatea SOD. Free Radic Biol Med. iunie 1994; 16 (6): 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Chemiluminescență vizibilă asociată cu reacția dintre methemoglobină sau oxihemoglobină cu peroxid de hidrogen. Photochem Photobiol. 1994 noiembrie; 60 (5): 405-11.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV, et al. Evaluarea in vitro a activității antioxidante a flavonolilor lipozomal prin sistemul HRP-H2O2-luminol. J Microcapsul. 2011; 28 (4): 258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. O investigație a mecanismului

a peroxidării luminiscente a luminolului prin tehnici de curgere oprită. J Biol Chem. 25 septembrie 1968; 243 (18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Caracteristicile fitochimice, activitățile de captare a radicalilor liberi și neuroprotecția a cinci extracte de plante medicinale. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 2011 10 august.

19. Chang CL, Lin CS. Compoziția fitochimică, activitatea antioxidantă și efectul neuroprotector al extractelor de Terminalia chebula Retzius. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011 5 iulie.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Evaluarea activității antioxidante a diferitelor flavonoide prin metoda chemiluminiscenței. AAPS PharmSci. 2003; 5 (2): 111-5.

21. Alekseev AV, Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Opredelenie antioksidantov metodom aktivirovannoi khemilyuminestsentsii s ispol"zovaniem 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana). Buletinul de chimie al Universității din Moscova. 2012; 53 (3): 187-93. Rusă.

22. Pogacnik L, Ulrih NP. Aplicarea testului de chemiluminiscență optimizat pentru determinarea capacității antioxidante a extractelor din plante. Luminescență. 2012 noiembrie-dec; 27 (6): 505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Total de antioxidanți cu greutate moleculară mică ca parametru rezumat, cuantificat în probe biologice printr-un test de inhibare a chemiluminiscenței. Nat Protoc. 2010 septembrie; 5 (10): 1627-34.

24. Ministerstvo zdravookhraneniya SSSR. Gosudarsvennaya farmakopeya SSSR. a 11-a ed. Iss. 2. „Analiza metodei Obshchie”.

Lekarstvennoe rastitel "noe syr"e". Moscova: Medltsina; 1987. p. 147-8. rusă.

25. Sergunova EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Izuchenie ekstraktsionnykh preparatov shipovnika. Farmacie. 2012; (2): 14-6. Rusă.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Izuchenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposobov konservatsii i vodnykh izvlechenii. Farmatsiya. 2010; (5): 16-8. Rusă.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov i vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Farmatsiya. 2014; (1): 8-10. Rusă.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - syr"ya dlya prigotovleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Actele celei de-a 14-a Conferințe Homeopatice Internaționale de la Moscova „Razvitie gomeopaticheskogo methoda v sovremennoi ; 014. p. 146- 7. rusă.

29. Sergunova EV, Sorokina AA. Izuchenie sostava biologicalheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom syr"e razlichnykh sposobov konservatsii. Actele celui de-al 20-lea Congres național rus „Chelovek i lekarstvo”; 2013 apr 1519; Moscova. Moscova: EkOOnis; 2013. p. 184-90. Rusă.

30. Aleksandrova EYu, Orlova MA, Neiman PL. Izuchenie peroksidaznoi aktivnosti v ekstraktakh iz kornevishcha i kornei khrena i ee stabil"nosti k razlichnym vozdeistviyam. Buletinul Universității de Chimie din Moscova. 2006; 47 (5): 350-2. Rusă.

] însă, definiția antioxidanților ca compuși chimici nu oferă o imagine completă a proprietăților protectoare ale obiectului studiat: aceștia sunt determinati nu numai de cantitatea unui anumit antioxidant, ci și de activitatea fiecăruia dintre ei. Activitatea antioxidantă sau activitatea antioxidantă, AOA, este constanta de viteză a reacției unui antioxidant cu un radical liber (kInH). Metoda chemiluminiscenței (CL) vă permite să determinați cantitatea totală de radicali care leagă antioxidanții într-o probă (capacitate antioxidantă totală, TAU), iar atunci când utilizați metoda de modelare matematică a cineticii CL, de asemenea, rata de formare și reacție a radicalilor cu antioxidanți, adică AOA [, ,].

Cea mai comună modificare a metodei chemiluminiscenței pentru determinarea capacității antioxidante totale se bazează pe utilizarea luminolului ca activator al chemiluminiscenței [, , ,]. O probă este plasată într-o cuvă de chemiluminometru cu adaos de luminol, peroxid de hidrogen și un compus capabil să formeze radicali ca rezultat al descompunerii spontane (termoliza), de exemplu diclorhidrat de 2,2'-azobis-(2-amidinopropan) (ABAP). ): ABAP → 2R. În prezenţa oxigenului molecular, radicalul alchil R formează radicalul peroxil ROO: R + O 2 → ROO. În continuare, radicalul peroxil oxidează sonda chemiluminiscentă luminol (LH 2), iar radicalul luminol (LH) se formează: ROO + LH 2 → ROOH + LH. Din LH, prin formarea unor substanțe intermediare (hidroperoxid de luminol și endoperoxid de luminol), se formează o moleculă din produsul final al oxidării luminolului, acidul aminoftalic, în stare excitată electronic, care emite un foton și ca urmare se observă chemiluminiscența. . Intensitatea CL este proporțională cu rata producției de fotoni și, la rândul său, este proporțională cu concentrația staționară de LH în sistem. Prin interacțiunea cu radicalii, antioxidanții întrerup lanțul de transformări descris și previn formarea unui foton.

Compușii susceptibili la termoliză nu sunt singura sursă posibilă de radicali atunci când se analizează capacitatea antioxidantă a unei probe prin metoda chemiluminiscentă. Alternativele sunt sistemele peroxidază de hrean-peroxid de hidrogen [, ], hemin-peroxid de hidrogen, citocrom Cu–cardiolipină–peroxid de hidrogen etc. Schema de reacție pentru oxidarea luminolului de către peroxidaze este considerată în lucrarea lui Cormier și colab. .

Curbele cinetice CL pentru aceste sisteme reflectă două etape ale reacției: etapa de creștere a intensității CL și etapa unui platou sau scădere treptată a luminiscenței, când intensitatea CL este fie constantă, fie scade lent. Lucrarea descrie două abordări pentru măsurarea capacității antioxidante totale care iau în considerare această caracteristică a curbelor. Metoda TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) se bazează pe măsurarea perioadei de latentă a CL τ și pot fi utilizate pentru determinarea antioxidanților precum Trolox sau acidul ascorbic: se caracterizează printr-o constantă mare de reacție cu radicalii și din acest motiv pot fi numiți antioxidanți puternici. În perioada de latentă are loc oxidarea lor completă. Metoda TAR (Total Antioxidant Reactivity) măsoară gradul de stingere a chimioluminiscenței q la platoul sau maximul curbei de chemiluminiscență: formulă, unde I este intensitatea chemiluminiscenței fără antioxidant, iar I 1 este intensitatea CL în prezența unui antioxidant. Această metodă este utilizată dacă sistemul conține predominant antioxidanți slabi cu constante de interacțiune cu rată scăzută cu radicalii - mult mai scăzută în comparație cu constanta luminolului.

Efectul antioxidanților este caracterizat nu numai de indicatori τ Și q. După cum se poate observa din lucrări [,], efectul antioxidanților precum acidul uric în sistemul hemin–H 2 O 2 –luminol sau tocoferolul, rutina și quercetina în sistemul citocromului Cu–cardiolipină–H 2 O 2 –luminol, caracterizată printr-o modificare a ratei maxime de creștere a CL ( v max). După cum arată rezultatele modelării matematice a cineticii, valorile constantelor vitezei de interacțiune a acestor antioxidanți cu radicalii sunt apropiate de valoarea constantei luminolului, prin urmare, astfel de antioxidanți pot fi numiți antioxidanți de rezistență medie.

Dacă materialul studiat, în special materiile prime vegetale, conținea un singur tip de antioxidanți, atunci conținutul acestora ar putea fi caracterizat de unul dintre cei trei indicatori enumerați mai sus ( τ , q sau v max). Dar materialele vegetale conțin un amestec de antioxidanți de diferite puteri. Pentru a rezolva această problemă, unii autori [ , , , ] au folosit modificarea sumei luminii a chemiluminiscenței într-un anumit timp ∆S, calculată prin formula , unde ∆ S 0și ∆ S S- Sumele luminii CL pentru un timp dat tîn probele de control, respectiv de testare. Timpul trebuie să fie suficient pentru oxidarea tuturor antioxidanților din sistem, adică pentru ca curba CL a probei de testat să atingă nivelul curbei CL a probei martor. Acesta din urmă presupune că cercetătorii nu trebuie doar să înregistreze suma luminii a strălucirii, ci și să înregistreze curba cinetică CL pentru un timp suficient de lung, ceea ce nu se face întotdeauna.

Deoarece toți indicatorii măsurați depind de dispozitiv și de condițiile de măsurare, efectul antioxidant al substanței din sistemul studiat este de obicei comparat cu efectul unui antioxidant luat ca standard, de exemplu Trolox [,].

Sistemul peroxidază de hrean-peroxid de hidrogen a fost utilizat pentru a analiza capacitatea antioxidantă totală a materialelor vegetale de mulți autori. În lucrări [ , ] s-a utilizat perioada de latentă a CL (metoda TRAP) pentru estimarea cantității de antioxidanți din probe, iar în lucrări [ , , ] - aria de sub curba de dezvoltare CL. Cu toate acestea, lucrările enumerate nu oferă o justificare clară pentru alegerea unuia sau altuia parametru pentru evaluarea OAU.

MATERIALE ȘI METODE

Obiectele studiului au fost mostre industriale de păducel, rowan și măceș produse de JSC Krasnogorskleksredstva (Rusia), precum și fructe de zmeură colectate de autori în regiunea Moscovei în condiții naturale de creștere și uscate la o temperatură de 60–80 °. C până când au încetat să mai elibereze suc și să se deformeze la apăsare.

Reactivii pentru analiza capacităţii antioxidante prin metoda chemiluminiscentă au fost: KH 2 PO 4, soluţie tampon 20 mM (pH 7,4); peroxidază din rădăcini de hrean (activitate 112 unități/mg, M = 44.173,9), soluție apoasă 1 mM; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindionă, hidrazida acidului 3-aminoftalic, M = 177,11), soluţie apoasă 1 mM; peroxid de hidrogen (H202, M = 34,01), soluţie apoasă 1 mM; soluții de antioxidanți (acid ascorbic, quercetină, tocoferol). Toți reactivii sunt fabricați de Sigma Aldrich (SUA).

Determinarea capacității antioxidante totale a fost efectuată prin înregistrarea chemiluminiscenței pe un chemiluminometru Lum-100 (DISoft, Rusia) folosind software-ul PowerGraph 3.3. Pentru a determina OAE în materiale vegetale, 40 μl de luminol la o concentrație de 1 mM, 40 μl de peroxidază de hrean la o concentrație de 0,1 μM, de la 10 la 50 μl de decoct sau infuzie (în funcție de concentrație) și tampon fosfat în cantitatea necesară au fost plasate în cuva aparatului.pentru a aduce volumul total de probă la 1 ml. Cuva a fost instalată în aparat și a fost înregistrat CL, observând semnalul de fundal. După 48 s de înregistrare a semnalului de fundal, în cuvă s-au adăugat 100 μl de H2O2 la o concentrație de 1 mM și înregistrarea CL a fost continuată timp de 10 minute. Au fost preparate patru probe cu concentrații diferite ale fiecărui obiect vegetal. CL a fost înregistrat, de asemenea, pentru soluții de acid ascorbic, quercetină și tocoferol la cinci concentrații diferite pentru fiecare antioxidant. Ulterior, OAU a probelor de decocturi și infuzii a fost recalculată la quercetină.

Concentrațiile de luminol, peroxidază de hrean și peroxid de hidrogen au fost selectate astfel încât să se determine capacitatea antioxidantă a extractelor apoase din plante medicinale într-un timp acceptabil (nu mai mult de 10 min). În acest timp, curbele de chemiluminiscență pentru antioxidanții ascorbat și flavonoid quercetina (principalii antioxidanți ai materialelor vegetale) au atins un platou, indicând distrugerea completă a antioxidanților din sistem. Diluțiile probelor studiate și concentrațiile de soluții de antioxidanți standard (indicate în legendele figurilor) au fost selectate în așa fel încât toate curbele cinetice CL au fost măsurate la aceeași sensibilitate a dispozitivului.

Capacitatea antioxidantă a fost calculată din modificarea ariei (∆ S) sub curba cinetică a chemiluminiscenței (suma luminii) la adăugarea unei substanțe care conține un antioxidant. În acest scop am calculat S 0 pentru un sistem fără antioxidant și a scăzut zona din acesta S S, care caracterizează sistemul la care s-a adăugat antioxidantul. Valoarea ∆ S depinde de sensibilitatea chemiluminometrului și de condițiile de măsurare. Raportul ∆ S/C V(Unde C- concentraţia materialului biologic studiat în cuvă, g/l, şi V- volumul cuvei, l) exprimă capacitatea antioxidantă a 1 g din materialul studiat, adică materii prime vegetale.

Capacitatea antioxidantă ∆ a fost calculată în mod similar S A o soluție dintr-un antioxidant standard, de exemplu quercetină, plasată în același volum al amestecului de reacție. Raportul ∆ S A /C A V(Unde C A- concentratia in greutate a antioxidantului in cuva, g/l) exprima capacitatea antioxidanta a 1 g de antioxidant.

Pentru fiecare dintre antioxidanții standard, semnalul din soluții de mai multe concentrații a fost înregistrat pentru a se asigura că calculele au fost într-o relație liniară și rezultatele obținute sunt reproductibile. Într-adevăr, s-a obținut o dependență liniară (∆ S A = k A C A) semnal de la concentrația din care s-a calculat coeficientul stoichiometric k A. Conform criteriului Fisher, valorile obținute pentru antioxidanții standard k A semnificativ statistic cu o probabilitate de 0,975. Apoi, semnalul de la patru concentrații a fost înregistrat pentru fiecare dintre cele patru eșantioane de plante, iar pentru toate probele s-a obținut o dependență liniară a semnalului de concentrație (∆ S = k·C), din care s-a calculat coeficientul stoichiometric k. Cu o probabilitate de 0,975 (testul lui Fisher), valorile k obținute pentru probele de plante sunt semnificative statistic. Capacitatea antioxidantă totală a materialului vegetal în ceea ce privește masa antioxidantului standard (mg%) a fost găsită folosind formula.

Valorile au fost prezentate ca medie aritmetică ± abatere standard (M ± δ) la p

REZULTATE CERCETĂRI

Studiul cineticii chemiluminiscenței în prezența ascorbatului de sodiu (Fig. 1. Efectul ascorbatului de sodiu asupra cineticii chemiluminiscenței" data-note="Concentrațiile componentelor sistemului: luminol - 40 µM, peroxidază de hrean - 4 nM, peroxid de hidrogen - 100 µM. Curbele: 1 - proba de control; 2 - 0,05 µM; 3 - 0,10 µM; 4 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM; 6 - 0,25 µM ascorbat de sodiu.">Fig. 1) a arătat că pentru acest antioxidant este caracterizată printr-o perioadă de latentă când CL este aproape complet suprimată.Durata sa este proporțională cu cantitatea de antioxidant din sistem.Totodată, nu se modifică nici panta curbelor CL și nici intensitatea CL pe platou.Asta se explică. prin faptul că acidul ascorbic este un antioxidant puternic care interceptează toți radicalii formați în sistem, inclusiv radicalii luminol, iar CL nu se dezvoltă până când tot ascorbatul nu este oxidat.

Alți cercetători au arătat, de asemenea, că rezultatele analizei chimice și valoarea TAU determinată prin metoda chemiluminiscentă adesea nu coincid. În lucrare, capacitatea antioxidantă totală determinată în sistemul peroxidază-luminol-peroxid de hidrogen sa corelat cu conținutul de compuși triterpenici. Totuși, în lucrările acelorași autori, în care obiectul de studiu a fost o altă plantă, aceștia nu au observat o corelație a OAE cu conținutul niciunui grup de substanțe, inclusiv flavonoide.

Astfel de discrepanțe sunt asociate cu cel puțin trei factori. În primul rând, activitatea antioxidanților este importantă, adică rata de interacțiune a acestora cu radicalii, care este diferită pentru diferiții antioxidanți incluși în proba de plantă. Potrivit lui Izmailov, constantele de viteză ale reacțiilor corespunzătoare pentru mexidol, tocoferol și quercetină se corelează ca 0,04: 2: 60. În al doilea rând, fiecare moleculă antioxidantă, care intră într-o reacție chimică, poate intercepta un număr diferit de radicali. Conform lucrării, acizii quercetină, uric și ascorbic au interceptat 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 și, respectiv, 0,5 ± 0,2 radicali per moleculă antioxidantă reacționată (s-a folosit sistemul hemin–H 2 O 2 -luminol). În al treilea rând, rezultatele studiului ar putea fi influențate de prezența activității peroxidazei în probele de plante în sine, ca și în lucrare, precum și de prezența calciului în probe, care, așa cum se arată în lucrare, este capabil să crească. activitatea peroxidazei de hrean în anumite condiţii. Acest lucru determină de obicei o intensitate CL mai mare pe platou decât pe curbele de control, ceea ce noi însă nu am observat.

Primul factor limitează drastic utilizarea unui astfel de parametru ca modificare a sumei luminii, deoarece timpul de măsurare a chimioluminiscenței trebuie să fie mai mare decât timpul pentru consumul tuturor antioxidanților din proba de testat. Apariția acestui moment poate fi judecată doar prin măsurarea cineticii chemiluminiscenței. În plus, contribuția antioxidanților slabi la TAU este puternic subestimată, deoarece timpul pentru oxidarea lor completă este de multe ori mai mare decât durata de măsurare acceptabilă (10-20 min).

Coeficientul stoichiometric al antioxidantului este și mai important. Numărul de radicali n interceptat de acesta este egal cu , unde ρ este coeficientul stoichiometric și ∆ m- modificarea concentrației de antioxidant în timpul măsurării, în cazul nostru - concentrația inițială a substanței de testat în proba de testat.

Diferența dintre suma luminoasă a luminiscenței în absența unui antioxidant și în prezența acestuia este proporțională n. Numărul total de radicali interceptați este , unde ρ i este coeficientul stoichiometric al unui antioxidant specific și m i- concentratia acestuia in timpul masurarii. Numărul total de radicali interceptați nu este în mod evident egal cu cantitatea totală de antioxidanți, deoarece coeficienții ρ i nu numai că nu sunt egale cu unitatea, dar diferă semnificativ și pentru diferiți antioxidanți.

Magnitudinea n este proporțională cu diferența de sume de lumină măsurate într-un anumit timp între o probă care conține un antioxidant și o probă martor care nu conține antioxidanți: S = k n, Unde k- coeficient, constant în aceleași condiții de măsurare.

Condițiile pe care le-am selectat pentru evaluarea capacității antioxidante totale a materiilor prime vegetale prin înregistrarea cineticii chemiluminiscenței într-un sistem format din peroxidază de hrean, peroxid de hidrogen și luminol (concentrații componente - 4 nM, 100 µM, respectiv 40 µM; fosfat 20 mM). tampon, pH 7,4), a asigurat oxidarea antioxidanților puternici (acid ascorbic) și a antioxidanților cu tărie medie (quercetină) în 10 minute. Această durată de măsurare este convenabilă și asigură calitatea necesară a măsurării.

Făcând clic pe butonul „Descărcați arhiva”, veți descărca gratuit fișierul de care aveți nevoie.
Înainte de a descărca acest fișier, gândiți-vă la acele eseuri bune, teste, lucrări, disertații, articole și alte documente care sunt nerevendicate pe computerul dvs. Aceasta este munca ta, ar trebui să participe la dezvoltarea societății și să beneficieze oamenii. Găsiți aceste lucrări și trimiteți-le la baza de cunoștințe.
Noi și toți studenții, studenții absolvenți, tinerii oameni de știință care folosesc baza de cunoștințe în studiile și munca lor vă vom fi foarte recunoscători.

Pentru a descărca o arhivă cu un document, introduceți un număr de cinci cifre în câmpul de mai jos și faceți clic pe butonul „Descărcați arhiva”

Documente similare

Studiul căilor enzimatice și neenzimatice de formare a speciilor reactive de oxigen. Mecanismele efectelor lor dăunătoare asupra celulelor vii, în special, inițierea peroxidării lipidelor cu radicali liberi. Protectia antioxidanta a organismului.

lucru curs, adăugat 01.11.2017

Activitatea antioxidantă a materialelor vegetale. Descrierea plantelor cu activitate antioxidantă. Determinarea conținutului de vitamina C în viburnum vulgaris în perioada de maturare, a conținutului de compuși polifenolici din diferite tipuri de ceai.

teză, adăugată 04.02.2009

Giberelinele sunt o clasă largă de fitohormoni care reglează creșterea și dezvoltarea: istoria descoperirii, structura chimică, clasificarea, conținutul în plante. Biochimia, funcțiile de reglare și activitatea biologică a giberelinelor, structura lor, proprietăți.

prezentare, adaugat 20.10.2014

rezumat, adăugat 19.05.2017

Activitatea biologică și structura chimică a brassinosteroizilor. Sinteze cu conservarea scheletului de carbon. Formarea funcțiilor caracteristice părții ciclice a brassinosteroizilor. Construcția unui lanț lateral cu formarea de noi legături carbon-carbon.

lucrare curs, adaugat 12.07.2014

Studiul fiziologiei pancreasului, rolul sucului pancreatic în procesul digestiv. Analiza speciilor reactive de oxigen și a căilor de formare a acestora, biochimia proceselor radicalilor liberi. Revizuirea stării proceselor metabolice în pancreatita acută.

lucrare de curs, adăugată 03.10.2012

Compoziția chimică a genului Penstemon și activitatea biologică. Analiza fitochimică calitativă a materiilor prime vegetale folosind cromatografia în strat subțire. Determinarea compoziției cantitative a componentelor prin cromatografie lichidă de înaltă performanță.

lucrare practica, adaugata 01.07.2016

munca de absolvent

1.4 Metode de cercetare a antioxidantilor

activitatea antioxidantă se clasifică: după metodele de înregistrare a AOA manifestată (volumetrice, fotometrică, chemiluminiscentă, fluorescentă, electrochimică); după tipul sursei de oxidare; după tipul de compus care se oxidează; prin metoda de măsurare a compusului oxidat.

Cu toate acestea, cele mai cunoscute metode pentru determinarea activității antioxidante sunt:

1 TEAC (capacitate antioxidantă echivalentă trolox): metoda se bazează pe următoarea reacție:

Metmioglobină + H 2 O 2 > Ferilglobină + ABTS > ABTS * + AO.

Metoda echivalentelor Trolox (TEAC) se bazează pe capacitatea antioxidanților de a reduce cationii radicalilor 2,2-azinobis (ABTS) și, prin urmare, de a inhiba absorbția în regiunea cu lungime de undă lungă a spectrului (600 nm). Un dezavantaj semnificativ al metodei este reacția în două etape pentru a produce radicalul. Acest lucru prelungește timpul de analiză și poate crește dispersarea rezultatelor, în ciuda faptului că pentru analiză este utilizat un set standardizat de reactivi.

2 FRAP (ferric reducing antioxidant power): metoda se bazează pe următoarea reacție:

Fe(III)-tripiriditriazină+AO>Fe(II)-tripiridiltriazină.

Capacitate de reducere/antioxidantă a fierului (FRAP). Reacția utilizată aici este reducerea Fe(III)-tripiridiltriazină la Fe(II)-tripiridiltriazină. Cu toate acestea, această metodă nu poate determina determinarea unor antioxidanți, cum ar fi glutationul. Această metodă permite determinarea directă a antioxidanților cu greutate moleculară mică. La pH scăzut, reducerea complexului Fe(III)-tripiridiltriazină la complexul Fe(II) este însoțită de apariția unei culori albastre intense. Măsurătorile se bazează pe capacitatea antioxidanților de a suprima efectul oxidativ al speciilor de reacție generate în amestecul de reacție. Această metodă este simplă, rapidă și ieftină de implementat.

3 ORAC (capacitate de absorbție a radicalilor de oxigen): metoda se bazează pe următoarea reacție:

Fe(II)+H2O2 >Fe(III) + OH*+AO>OH* + Luminol.

Determinarea capacității de absorbție a radicalilor de oxigen (ORAC). În această metodă, se înregistrează fluorescența unui substrat (ficoeritrina sau fluoresceină), care apare ca urmare a interacțiunii sale cu ROS. Dacă proba de testat conține antioxidanți, atunci se observă o scădere a fluorescenței în comparație cu proba de control. Această metodă a fost dezvoltată inițial de Dr. Guohua Kao la Institutul Național pentru Îmbătrânire în 1992. În 1996, Dr. Kao a făcut echipă cu Dr. Ronald Pryer într-un grup comun la Centrul de Cercetare a Îmbătrânirii USDA, unde metoda semi-automatizată a fost creată.

4 TRAP (parametru antioxidant total de captare a radicalilor): metoda se bazează pe următoarea reacție:

AAPH+AO>AAPH* + PL (FE).

Această metodă profită de capacitatea antioxidanților de a interacționa cu radicalul peroxil 2,2-azobis(2-amidinopropan) diclorhidrat (AAPH). Modificările TRAP constau în metode de înregistrare a semnalului analitic. Cel mai adesea, în etapa finală a analizei, radicalul peroxi AAPH interacționează cu un substrat luminiscent (luminol), fluorescent (diacetat de diclorofluoresceină, DCFH-DA) sau alt substrat optic activ.

Derivatul de vitamina E solubil în apă Trolox (acid 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxi) este utilizat ca standard pentru metodele TEAC, ORAC și TRAP.

Recent, interesul pentru utilizarea metodelor electrochimice a crescut pentru a evalua activitatea antioxidantă. Aceste metode au sensibilitate ridicată și analiză rapidă.

Evaluarea activității antioxidante a unor produse alimentare se realizează prin metoda potențiometriei, bazată pe utilizarea proprietății substanțelor antioxidante de a participa la reacțiile redox datorate grupărilor enol (-OH) și sulfhidril (-SH).

Determinarea proprietăților antioxidante ale soluțiilor se bazează pe interacțiunea chimică a antioxidanților cu sistemul mediator, ceea ce duce la modificarea potențialului redox al acestuia. O celulă electrochimică este un recipient care conține o soluție tampon K-Na-fosfat, un sistem mediator Fe(III)/Fe(II) și un electrod complex înainte de măsurarea potențialului redox. Activitatea antioxidantă este evaluată în g-eq/l.

Metoda amperometrică de determinare a activității antioxidante se bazează pe măsurarea curentului electric care apare în timpul oxidării substanței de testat pe suprafața electrodului de lucru, care se află sub un anumit potențial. Sensibilitatea metodei amperometrice este determinată atât de natura electrodului de lucru, cât și de potențialul aplicat acestuia. Limita de detecție a detectorului amperometric de polifenoli și flavonoide este la nivel de nano-picogramă; la astfel de concentrații scăzute, există o probabilitate mai mică de influență reciprocă a diferiților antioxidanți atunci când sunt prezenți împreună, în special manifestarea fenomenului de sinergie. . Dezavantajele metodei includ specificitatea acesteia: în aceste condiții, antioxidanții care ei înșiși sunt oxidați sau redusi în regiunea potențialelor de electroreducere a oxigenului nu pot fi analizați. Avantajele metodei includ viteza, prostata și sensibilitatea.

Metoda de coulometrie galvanostatică folosind oxidanți generați electric - metoda este aplicabilă pentru analiza antioxidanților liposolubili.

Au fost dezvoltate diferite metode pentru determinarea acidului ascorbic:

metoda amperometrică folosind un electrod de aluminiu modificat cu o peliculă de hexacianoferat de nichel (II) prin imersare simplă într-o soluție;

o metodă pentru determinarea testului spectrofotometric și vizual în fază solidă a acidului ascorbic folosind xerogel de acid silicic modificat cu reactiv Wawele și cupru (II) ca pulbere indicator;

determinarea chemiluminiscentă a acidului ascorbic poate fi efectuată prin metoda injectării în flux folosind reacția chemiluminiscentă a rodaminei B cu ceriu (IV) într-un mediu de acid sulfuric.

determinarea acidului ascorbic în intervalul 10 -8 -10 -3 g/cm 3 prin voltametrie anodică în medii apoase şi apos-organice.

Cea mai comună este metoda FRAP, deoarece este rapidă și foarte sensibilă. În ultimele decenii, au fost dezvoltate un număr mare de varietăți de metode pentru determinarea activității antioxidante folosind metoda FRAP (Tabelul 1).

Tabelul 1 Dezvoltarea metodei FRAP și aplicarea acesteia pentru a determina activitatea antioxidantă a diferitelor obiecte

	Obiecte de analiză	Note
	Plasma din sânge	t=4min. S-au studiat stoichiometria reacției și aditivitatea.
	Ceai, vin	Determinarea AOA datorată polifenolilor
		Au fost comparate valorile AOA ale diferitelor soiuri de ceai
Pulido,Bravo,Saura-Calixto	Soluții model	t=30min. A fost dezvăluită influența unui solvent neapos
	Plante
	Sânge, țesut	Metoda PIA. Influența substanțelor străine a fost testată.
Firuzi, Lacanna, Petrucci e.a.	Soluții model	Sensibilitatea determinării diferitelor AO a fost studiată în funcție de structura lor și de potențialul redox.
Katalinic, Milos,	Vinuri diverse
Temerdashev, Tsyupko și alții.	Amestecuri model
Loginova, Konovalova	Medicamente Medicamente	Metoda de test
Temerdashev, Tsyupko și alții.	Vinuri roșii seci	Corelarea AOA cu alți indicatori ai calității vinului
Continuarea tabelului 1
	Amestecuri model	S-a studiat sensibilitatea determinării diferitelor AO
Vershinin, Vlasova, Tsyupko	Amestecuri model	S-a constatat că semnalul nu este aditiv atunci când a existat o lipsă de agent oxidant
Anisimovici, Deineka și alții.	Soluții model	Au fost propuși parametri cinetici pentru evaluarea AOA.

Note: Denumite convențional: analiză de injecție FIA-flow, TPTZ-tripiridiltriazină, DIP-2,2,-dipiridil, PHEN-o-fenantrolină, acid DPA-piridindicarboxilic, FZ-ferozină, AA-acid ascorbic, CT-catecol, t - timpul de expunere, min.

Interacțiunea dintre proteine și polielectroliți în soluții apoase

Sunt utilizate diferite metode analitice pentru a caracteriza complecșii proteină-polielectroliți. Metodele instrumentale oferă informații despre proprietățile structurale și optice și, de asemenea, determină dinamica și natura legării PEC...

Efectul compușilor d-metali asupra vitezei de disociere a unei molecule de apă într-o membrană bipolară

În procesul de sinteză a noilor BPM, trebuie acordată o mare atenție studierii proprietăților probelor obținute pentru selectarea ulterioară a condițiilor de sinteză care să asigure îmbunătățirea caracteristicilor electrochimice ale membranelor sintetizate...

Medicamente de design și canabinoizi sintetici

Detectarea canabinoizilor sintetici în amestecuri de plante poate fi efectuată prin diferite metode fizico-chimice, cum ar fi cromatografia-spectrometrie de masă, cromatografia în gaz, cromatografia în strat subțire și cromatografia lichidă de înaltă performanță...

Dezvoltarea unei metode pentru determinarea flavonoidelor din materialele vegetale medicinale

Sinteza și proprietățile farmacologice ale chinolinone-2

Obiectul de studiu: Chinolinona-2. Metoda de cercetare: Folosind programul de calculator „Marvin JS”, a fost creată structura substanței. Apoi a fost trimisă pe site-ul „http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php” pentru cercetări suplimentare...

Metodă spectrală termică pentru studierea produselor de evaporare a polimerilor epoxidici

Tehnologie pentru producerea chitosanului înalt purificat din coji de crustacee

Determinarea greutății moleculare a chitosanului Greutatea moleculară a chitosanului a fost determinată vâscometric folosind o metodă standard. Soluțiile de concentrație 0,05 și 0,5 g/dL au fost preparate prin dizolvarea unei probe de pulbere de polimer în tampon acetat (0...

Caracteristicile fiziografice ale teritoriului parcului natural

Secțiuni