Mikroskopické metódy výskumu. Mikroskopické metódy

Domov

Dodávka vody

Mikroskopické metódy výskumu- spôsoby skúmania rôznych predmetov pomocou mikroskopu. V biológii a medicíne tieto metódy umožňujú študovať štruktúru mikroskopických objektov, ktorých rozmery presahujú rozlišovaciu schopnosť ľudského oka. Základom je svetelná a elektrónová mikroskopia. V praktickej a vedeckej činnosti lekári rôznych odborností - virológovia, mikrobiológovia, cytológovia, morfológovia, hematológovia atď., okrem klasickej svetelnej mikroskopie využívajú fázovo kontrastnú, interferenčnú, luminiscenčnú, polarizačnú, stereoskopickú, ultrafialovú, infračervenú mikroskopiu. Tieto metódy sú založené na rôznych vlastnostiach svetla. V elektrónovej mikroskopii vzniká obraz predmetov štúdia v dôsledku usmerneného toku elektrónov.

Pre svetelnú mikroskopiu a iné na nej založené mikroskopické metódy výskumu definovanie hodnoty okrem rozlíšenia mikroskop má povahu a smer svetelného lúča, ako aj vlastnosti skúmaného objektu, ktorý môže byť priehľadný a nepriehľadný. V závislosti od vlastností objektu sa menia fyzikálne vlastnosti svetla – jeho farba a jas súvisiaci s vlnovou dĺžkou a amplitúdou, fázou, rovinou a smerom šírenia vĺn. Na využitie týchto vlastností svetla, rôzne mikroskopické metódy výskumu. Pre svetelnú mikroskopiu sa biologické objekty zvyčajne farbia, aby sa odhalila jedna alebo druhá z ich vlastností ( ryža. jeden ). V tomto prípade musia byť tkanivá fixované, pretože. farbenie odhalí určité štruktúry iba usmrtených buniek. V živej bunke je farbivo izolované v cytoplazme vo forme vakuoly a nefarbí jej štruktúru. Živé biologické objekty však možno študovať aj vo svetelnom mikroskope metódou vitálnej mikroskopie. V tomto prípade sa používa tmavý kondenzor, ktorý je zabudovaný v mikroskope.

Mikroskopia s fázovým kontrastom sa používa aj na štúdium živých a nezafarbených biologických objektov. Je založená na difrakcii lúča svetla v závislosti od charakteristík vyžarovaného objektu. Tým sa mení dĺžka a fáza svetelnej vlny. Objektív špeciálneho mikroskopu s fázovým kontrastom obsahuje priesvitnú fázovú doštičku. Živé mikroskopické predmety alebo pevné, ale nie farebné mikroorganizmy a bunky vďaka svojej priehľadnosti prakticky nemenia amplitúdu a farbu svetelného lúča, ktorý nimi prechádza. spôsobí len fázový posun jeho vlny. Po prechode skúmaným objektom sa však svetelné lúče odchýlia od priesvitnej fázovej platne. V dôsledku toho vzniká rozdiel vo vlnovej dĺžke medzi lúčmi, ktoré prešli objektom, a lúčmi svetlého pozadia. Ak je tento rozdiel aspoň 1/4 vlnovej dĺžky, objaví sa vizuálny efekt, v ktorom je tmavý objekt jasne viditeľný na svetlom pozadí alebo naopak, v závislosti od charakteristík fázovej dosky.

Interferenčná mikroskopia rieši rovnaké problémy ako mikroskopia s fázovým kontrastom. Ak nám však tento umožňuje pozorovať iba obrysy predmetov štúdia, potom pomocou interferenčnej mikroskopie je možné študovať detaily priehľadného objektu a vykonávať ich kvantitatívnu analýzu. To sa dosiahne rozdvojením lúča svetla v mikroskope: jeden z lúčov prechádza cez časticu pozorovaného objektu a druhý okolo nej. V okuláre mikroskopu sú oba lúče spojené a navzájom sa rušia. Výsledný fázový rozdiel možno merať tak, že sa určí. mnoho rôznych bunkových štruktúr. Sekvenčné meranie fázového rozdielu svetla so známymi indexmi lomu umožňuje určiť hrúbku živých predmetov a nefixovaných tkanív, koncentráciu vody a sušiny v nich, obsah bielkovín atď. Na základe údajov interferenčnej mikroskopie možno nepriamo posúdiť priepustnosť membrán, aktivitu enzýmov a bunkový metabolizmus predmetov štúdia.

Polarizačná mikroskopia umožňuje študovať predmety skúmania vo svetle tvorenom dvoma lúčmi polarizovanými vo vzájomne kolmých rovinách, t.j. v polarizovanom svetle. Na to sa používajú filmové polaroidy alebo Nicol hranoly, ktoré sa vložia do mikroskopu medzi zdroj svetla a prípravok. Polarizácia sa mení pri prechode (alebo odraze) svetelných lúčov cez rôzne štruktúrne zložky buniek a tkanív, ktorých vlastnosti sú nehomogénne. V takzvaných izotropných štruktúrach rýchlosť šírenia polarizovaného svetla nezávisí od roviny polarizácie, v anizotropných štruktúrach sa rýchlosť šírenia mení v závislosti od smeru svetla pozdĺž pozdĺžnej alebo priečnej osi objektu. Ak je index lomu svetla pozdĺž štruktúry väčší ako v priečnom smere, vzniká pozitívny dvojlom, s opačnými vzťahmi - negatívny dvojlom. Mnohé biologické objekty majú striktnú molekulárnu orientáciu, sú anizotropné a majú pozitívny dvojitý lom svetla. Takéto vlastnosti majú myofibrily, mihalnice ciliovaného epitelu, neurofibrily, kolagénové vlákna atď. ryža. 2 ). Polarizačná mikroskopia je jednou z histologické výskumné metódy, spôsobom mikrobiologická diagnostika, nájde uplatnenie v cytologické štúdie a iné.V tomto prípade je možné v polarizovanom svetle skúmať zafarbené aj nezafarbené a nefixované, takzvané natívne preparáty tkanivových rezov.

Fluorescenčná mikroskopia je široko používaná. Je založená na vlastnosti niektorých látok dávať luminiscenciu - luminiscenciu v UV lúčoch alebo v modrofialovej časti spektra. Mnohé biologické látky, ako sú jednoduché bielkoviny, koenzýmy, niektoré vitamíny a liečivá, majú svoju vlastnú (primárnu) luminiscenciu. Ostatné látky začnú žiariť až vtedy, keď sa k nim pridajú špeciálne farbivá – fluorochrómy (sekundárna luminiscencia). Fluorochrómy môžu byť v bunke distribuované difúzne alebo selektívne farbiť jednotlivé bunkové štruktúry alebo určité chemické zlúčeniny biologického objektu. Toto je základ pre použitie luminiscenčnej mikroskopie v cytologických a histochemických štúdiách (pozri. Metódy histochemického výskumu). Pomocou imunofluorescencie vo fluorescenčnom mikroskope sa zisťujú vírusové antigény a ich koncentrácia v bunkách, identifikujú sa vírusy, stanovujú sa antigény a protilátky, hormóny, rôzne metabolické produkty a pod. ( ryža. 3 ). V tomto smere sa fluorescenčná mikroskopia využíva pri laboratórnej diagnostike infekcií ako je herpes, mumps, vírusová hepatitída, chrípka a pod., využíva sa pri rýchlej diagnostike respiračných vírusových infekcií, skúmaní odtlačkov z nosovej sliznice pacientov a v diferenciálna diagnostika rôznych infekcií. V patomorfológii sa pomocou luminiscenčnej mikroskopie rozpoznávajú zhubné nádory v histologických a cytologických preparátoch, stanovujú sa oblasti ischémie srdcového svalu v skorých štádiách infarktu myokardu, zisťuje sa amyloid v tkanivových biopsiách atď.

Ultrafialová mikroskopia je založená na schopnosti určitých látok, ktoré tvoria živé bunky, mikroorganizmy alebo fixované, ale nie farebné, priehľadné tkanivá vo viditeľnom svetle, absorbovať UV žiarenie s určitou vlnovou dĺžkou (400-250 nm). Túto vlastnosť majú vysokomolekulárne zlúčeniny, ako sú nukleové kyseliny, bielkoviny, aromatické kyseliny (tyrozín, tryptofán, metylalánium), purínové a pyramídové zásady atď. Pomocou ultrafialovej mikroskopie sa špecifikuje lokalizácia a množstvo týchto látok a v prípad štúdia živých predmetov, ich zmien v procese života.

Infračervená mikroskopia umožňuje študovať objekty, ktoré sú nepriehľadné pre viditeľné svetlo a UV žiarenie tým, že svojimi štruktúrami absorbuje svetlo s vlnovou dĺžkou 750-1200. nm. Pre infračervenú mikroskopiu nie je potrebné žiadne predbežné chemické ošetrenie vzoriek. Tento druh mikroskopické metódy výskumu najčastejšie sa používa v zoológii, antropológii a iných odvetviach biológie. V medicíne sa infračervená mikroskopia používa najmä v neuromorfológii a oftalmológii.

Stereoskopická mikroskopia sa používa na štúdium objemových objektov. Dizajn stereoskopických mikroskopov umožňuje vidieť predmet štúdia pravým a ľavým okom z rôznych uhlov. Preskúmajte nepriehľadné objekty pri relatívne malom zväčšení (až 120-krát). Používa sa stereoskopická mikroskopia mikrochirurgia, v patomorfológii so špeciálnym štúdiom biopsie, chirurgického a rezového materiálu, vo forenznom laboratórnom výskume.

Elektrónová mikroskopia sa používa na štúdium štruktúry buniek, tkanív mikroorganizmov a vírusov na subcelulárnej a makromolekulárnej úrovni. Tento M.m.i. umožnilo prejsť na kvalitatívne novú úroveň štúdia hmoty. Široké uplatnenie našiel v morfológii, mikrobiológii, virológii, biochémii, onkológii, genetike, imunológii Prudké zvýšenie rozlišovacej schopnosti elektrónového mikroskopu zabezpečuje tok elektrónov prechádzajúci vo vákuu cez elektromagnetické polia vytvárané elektromagnetickými šošovkami. Elektróny môžu prechádzať štruktúrami skúmaného objektu (transmisná elektrónová mikroskopia) alebo sa od nich odrážať (skenovacia elektrónová mikroskopia), pričom sa odchyľujú v rôznych uhloch, výsledkom čoho je obraz na luminiscenčnej obrazovke mikroskopu. Transmisnou (transmisnou) elektrónovou mikroskopiou sa získa rovinný obraz štruktúr ( ryža. 4 ), so skenovaním - objemovým ( ryža. 5 ). Kombinácia elektrónovej mikroskopie s inými metódami, ako je autorádiografia, histochémia, metódy imunologického výskumu, umožňuje vykonávať elektrón-rádioautografické, elektrón-histochemické, elektrón-imunologické štúdie.

Elektrónová mikroskopia si vyžaduje špeciálnu prípravu predmetov štúdia, najmä chemickú alebo fyzikálnu fixáciu tkanív a mikroorganizmov. Bioptický materiál a sekčný materiál sa po fixácii dehydrujú, nalejú do epoxidových živíc, režú sklenenými alebo diamantovými nožmi na špeciálnych ultratómoch, ktoré umožňujú získať ultratenké tkanivové rezy s hrúbkou 30-50 nm. Sú kontrastované a potom skúmané pod elektrónovým mikroskopom. V rastrovom (rastrovom) elektrónovom mikroskope sa študuje povrch rôznych predmetov tak, že sa na ne vo vákuovej komore ukladajú látky s hustotou elektrónov a skúmajú sa takzvané repliky, ktoré opakujú obrysy vzorky. pozri tiež

Hlavnou metódou na štúdium biologických mikroobjektov je svetelná a elektrónová mikroskopia, ktoré sú široko používané v experimentálnej a klinickej praxi.

Mikroskopia je hlavnou metódou štúdia mikroobjektov používanou v biológii už viac ako 300 rokov. Na štúdium histologických preparátov sa používajú rôzne typy svetelných mikroskopov a elektrónových mikroskopov. Od vzniku a používania prvých mikroskopov sa neustále zdokonaľovali. Moderné mikroskopy sú zložité optické systémy s vysokým rozlíšením. Veľkosť najmenšej štruktúry, ktorú je možné vidieť mikroskopom, je určená najmenšou rozlíšiteľnou vzdialenosťou (d), ktorá závisí najmä od vlnovej dĺžky svetla (λ) a od vlnovej dĺžky elektromagnetických kmitov toku elektrónov atď. je približne určená vzorcom d= λ/2. Čím je teda vlnová dĺžka kratšia, tým menšia je rozlíšiteľná vzdialenosť a tým menšie sú mikroštruktúry, ktoré možno v prípravku vidieť.

Svetelná mikroskopia. Na štúdium histologických mikroobjektov sa používajú bežné svetelné mikroskopy a ich odrody, v ktorých sa používajú svetelné zdroje s vlnami rôznych vlnových dĺžok. V konvenčných svetelných mikroskopoch je zdrojom osvetlenia prirodzené alebo umelé svetlo (obr. 2.1). Minimálna vlnová dĺžka viditeľnej časti spektra je približne 0,4 µm. Preto je pre bežný svetelný mikroskop najmenšia rozlíšiteľná vzdialenosť približne 0,2 µm a celkové zväčšenie (objektívne zväčšenie krát zväčšenie okuláru) môže byť 1500-2500.

Pomocou svetelného mikroskopu tak možno vidieť nielen jednotlivé bunky s veľkosťou od 4 do 150 mikrónov, ale aj ich vnútrobunkové štruktúry – organely, inklúzie. Na zvýšenie kontrastu mikroobjektov sa používa ich farbenie.

ultrafialová mikroskopia. Ide o typ svetelnej mikroskopie. Ultrafialový mikroskop využíva kratšie ultrafialové lúče s vlnovou dĺžkou asi 0,2 µm. Rozlíšiteľná vzdialenosť je tu 2-krát menšia ako u bežných svetelných mikroskopov a je približne 0,1 μm. Obraz získaný v ultrafialových lúčoch, okom neviditeľný, sa premení na viditeľný registráciou na fotografickej doske alebo pomocou špeciálnych zariadení (luminiscenčná obrazovka, elektrón-optický konvertor).

Fluorescenčná (luminiscenčná) mikroskopia. Fenomény fluorescencie spočívajú v tom, že atómy a molekuly množstva látok absorbujú krátke

Ryža. 2.1. Mikroskopy pre biologický výskum:

a- svetelný biologický mikroskop "Biolam-S": 1 - základňa; 2 - držiak rúrky; 3 - naklonená rúrka; 4 - okulár; 5 - revolver; 6 - šošovky; 7 - tabuľka; 8 - kondenzátor s irisovou clonou; 9 - skrutka kondenzátora; 10 - zrkadlo; 11 - mikrometrová skrutka; 12 - makrometrická skrutka; b- elektrónový mikroskop EMV-100AK s automatizovaným systémom spracovania obrazu: 1 - stĺpec mikroskopu (s elektrónovo-optickým systémom a komorou na vzorku); 2 - ovládací panel; 3 - kamera s luminiscenčnou obrazovkou; 4 - blok analýzy obrazu; 5 - snímač video signálu; v- konfokálny mikroskop: 1 - svetelný mikroskop; 2 - záznamník obrazu (fotoelektronický multiplikátor);

3 - snímacie zariadenie na pohyb svetelného lúča pozdĺž osi X, Y, Z;

4 - napájací zdroj a stojan na ovládanie lasera; 5 - počítač na spracovanie obrazu

vlnové lúče, prejdite do vzrušeného stavu. Spätný prechod z excitovaného stavu do normálneho stavu nastáva pri emisii svetla, ale s dlhšou vlnovou dĺžkou. Vo fluorescenčnom mikroskope sa ako svetelné zdroje na excitáciu fluorescencie používajú ultravysokotlakové ortuťové alebo xenónové výbojky, ktoré majú vysoký jas v spektrálnej oblasti 0,25–0,4 μm (blízko ultrafialových lúčov) a 0,4–0,5 μm (modré svetlo). fialové lúče). Vlnová dĺžka fluorescenčnej svetelnej vlny je vždy väčšia ako vlnová dĺžka excitačného svetla, preto sa oddeľujú pomocou svetelných filtrov a obraz objektu sa študuje iba vo svetle fluorescencie. Rozlišujte medzi vlastnou alebo primárnou a indukovanou alebo sekundárnou fluorescenciou. Každá bunka živého organizmu má svoju vlastnú fluorescenciu, ale často je extrémne slabá.

Serotonín, katecholamíny (adrenalín, noradrenalín) obsiahnuté v nervových, žírnych a iných bunkách majú primárnu fluorescenciu po fixácii tkaniva v parách formaldehydu pri 60-80 °C (Falkova metóda).

Sekundárna fluorescencia nastáva, keď sú prípravky ošetrené špeciálnymi farbivami - fluorochrómmi.

Existujú rôzne fluorochrómy, ktoré sa špecificky viažu na určité makromolekuly (akridínová oranž, rodamín, fluoresceín atď.). Napríklad, keď sú lieky liečené akridínovou oranžou, DNA a jej zlúčeniny v bunkách majú jasne zelenú žiaru, zatiaľ čo RNA a jej deriváty majú jasne červenú žiaru. Existuje mnoho farbív, ktoré možno použiť na identifikáciu proteínov, lipidov, vnútrobunkového vápnika, horčíka, sodíka atď. Spektrálne zloženie žiarenia teda nesie informácie o vnútornej štruktúre objektu a jeho chemickom zložení. Variant metódy fluorescenčnej mikroskopie, pri ktorej dochádza k excitácii aj emisii fluorescencie v ultrafialovej oblasti spektra, sa nazýva metóda ultrafialovej fluorescenčnej mikroskopie.

Ak chcete zvýšiť kontrast fluorochrómových predmetov, konfokálny variant optický mikroskop (pozri obr. 2.1, c). Ako osvetlenie sa používa lúč monochromatického svetla malého priemeru, ktorý vytvára laserový zdroj. V každom okamihu je v ohnisku mikroskopu malá oblasť (objem) bunky. Lúč svetla sa pohybuje nad objektom (skenuje objekt pozdĺž osí X, Y, Z). Pri každom pohybe svetelného lúča pozdĺž jednej zo skenovacích línií sa získajú informácie o študovanej štruktúre umiestnenej v danom bode (objeme) pozdĺž skenovacej línie (optická časť bunky), napríklad o lokalizácii proteínov. v mikrotubuloch v bunke. Všetky informácie prijaté z každého bodu skenovania bunky sa prenesú do počítača, skombinujú sa pomocou špeciálneho programu a zobrazia sa na obrazovke monitora vo forme kontrastného obrazu. Pomocou tejto metódy mikroskopie sa získajú informácie o tvare buniek, cytoskelete, štruktúre jadra, chromozómoch atď. Pomocou počítačového programu na základe informácií prijatých pre každú skenovaciu líniu vytvorí trojrozmerný obraz bunky, čo umožňuje zobraziť bunku z rôznych uhlov pohľadu.

Fázová kontrastná mikroskopia. Táto metóda sa používa na získanie kontrastných obrazov priehľadných a bezfarebných živých predmetov, ktoré sú bežnými mikroskopickými metódami neviditeľné. Metóda je založená na skutočnosti, že svetlo prechádzajúce štruktúrami s rôznymi indexmi lomu mení svoju rýchlosť. Konštrukcia použitej optiky mikroskopu umožňuje previesť okom nevnímané fázové zmeny svetla prechádzajúceho nefarbeným preparátom na zmeny jeho amplitúdy, teda jasu výsledného obrazu. Metóda fázového kontrastu poskytuje kontrast študovaných nefarbených štruktúr vďaka špeciálnej prstencovej membráne umiestnenej v kondenzore a takzvanej fázovej platni umiestnenej v objektíve. Variáciou metódy fázového kontrastu je metóda fázového kontrastu v tmavom poli, ktorá poskytuje negatívny obraz v porovnaní s pozitívnym fázovým kontrastom.

Mikroskopia v tmavom poli. V mikroskope s tmavým poľom sa k objektívu dostane len svetlo, ktoré vytvára difrakciu (ohýbanie vlny) štruktúr v preparáte. To sa deje v dôsledku prítomnosti špeciálneho kondenzátora v mikroskope, ktorý osvetľuje prípravok prísne šikmým svetlom; lúče z iluminátora smerujú zboku. Pole teda vyzerá tmavo a malé častice v prípravku odrážajú svetlo, ktoré potom vstupuje do šošovky. Na klinike sa táto metóda používa na štúdium kryštálov v moči (kyselina močová, oxaláty), na preukázanie spirochét, najmä Treponema pallidum, spôsobiť syfilis atď.

interferenčnej mikroskopie. Variáciou mikroskopu s fázovým kontrastom je interferenčný mikroskop, ktorý je určený na kvantifikáciu hmoty tkaniva. Na štúdium reliéfu povrchu buniek a iných biologických objektov sa používa diferenciálny interferenčný mikroskop (s Nomarského optikou).

V interferenčnom mikroskope je lúč svetla z iluminátora rozdelený do dvoch prúdov: jeden prechádza objektom a mení fázu oscilácie, druhý prechádza obchádzaním objektu. V hranoloch objektívu sa oba lúče navzájom prekrývajú. V dôsledku toho sa vytvorí obraz, v ktorom sa kontrastne líšia úseky mikroobjektu rôznej hrúbky a hustoty. Po kvantifikácii zmien stanovte koncentráciu a hmotnosť sušiny.

Mikroskopy s fázovým kontrastom a interferenčné mikroskopy vám umožňujú študovať živé bunky. Využívajú interferenciu, ku ktorej dochádza, keď sa spoja dve sady vĺn na vytvorenie obrazu mikroštruktúr. Výhodou fázového kontrastu, interferencií a mikroskopie v tmavom poli je schopnosť pozorovať bunky v procese pohybu a mitózy. V tomto prípade je možné zaznamenať pohyb buniek pomocou časozberného (snímku po snímke) mikrovidea.

polarizačná mikroskopia. Polarizačný mikroskop je modifikácia svetelného mikroskopu, v ktorej sú nainštalované dva polarizačné filtre: prvý (polarizačný) - medzi svetelný lúč a objekt a druhý (analyzátor) - medzi šošovku objektívu a oko. Svetlo prechádza cez prvý filter iba jedným smerom, druhý filter má hlavnú os,

ktorý je umiestnený kolmo na prvý filter a neprepúšťa svetlo. To vytvára efekt tmavého poľa. Štruktúry obsahujúce pozdĺžne orientované molekuly (kolagén, mikrotubuly, mikrofilamenty) a kryštalické štruktúry majú schopnosť otáčať osou svetelných lúčov vychádzajúcich z polarizátora. Keď sa zmení os otáčania, tieto štruktúry sa javia ako žiariace na tmavom pozadí. Schopnosť kryštálov alebo parakryštalických útvarov rozdeliť svetelnú vlnu na obyčajnú vlnu a na ňu kolmú vlnu sa nazýva dvojlom. Túto schopnosť majú fibrily priečne pruhovaných svalov.

Elektrónová mikroskopia. Veľkým krokom vpred vo vývoji mikroskopickej techniky bolo vytvorenie a využitie elektrónového mikroskopu (pozri obr. 2.1). Elektrónový mikroskop využíva prúd elektrónov s kratšími vlnovými dĺžkami ako svetelný mikroskop. Pri napätí 50 000 V je vlnová dĺžka elektromagnetických kmitov vznikajúcich pohybom prúdu elektrónov vo vákuu 0,0056 nm. Teoreticky sa vypočítalo, že rozlíšiteľná vzdialenosť za týchto podmienok môže byť asi 0,002 nm alebo 0,000002 μm, t.j. 100 000-krát menšia ako vo svetelnom mikroskope. V praxi je v moderných elektrónových mikroskopoch rozlíšiteľná vzdialenosť asi 0,1-0,7 nm.

V histológii sa využívajú transmisné (transmisné) elektrónové mikroskopy (TEM), rastrovacie (skenovacie) elektrónové mikroskopy (SEM) a ich modifikácie. Pomocou TEM možno získať len rovinný obraz skúmaného mikroobjektu. Na získanie priestorovej reprezentácie štruktúr sa používajú SEM, ktoré dokážu vytvoriť trojrozmerný obraz. Rastrovací elektrónový mikroskop pracuje na princípe skenovania skúmaného objektu elektrónovou mikrosondou, teda ostro zaostreným elektrónovým lúčom postupne „ohmatáva“ jednotlivé body povrchu. Táto štúdia objektu sa nazýva skenovanie(čítanie) a vzor, po ktorom sa mikrosonda pohybuje - raster. Výsledný obraz sa zobrazí na televíznej obrazovke, ktorej elektrónový lúč sa pohybuje synchrónne s mikrosondou.

Hlavnými výhodami rastrovacej elektrónovej mikroskopie sú veľká hĺbka ostrosti, široký rozsah kontinuálnych zmien zväčšenia (od desiatok až po desaťtisíckrát) a vysoké rozlíšenie. Moderné verzie prístrojov na štúdium povrchu objektu sú mikroskop atómovej sily a skenovací tunelový mikroskop.

Elektrónová mikroskopia metódou zmrazovania- štiepkovanie používa sa na štúdium detailov štruktúry membrán a medzibunkových spojení. Bunky sa zmrazia pri nízkej teplote (-160 °C), aby sa vytvorili čipy. Pri skúmaní membrány prechádza rovina štiepenia stredom lipidovej dvojvrstvy. Ďalej sa na vnútorných povrchoch získaných polovíc membrán ukladajú kovy (platina, paládium, urán), študujú sa pomocou TEM a mikrofotografie.

Metóda kryoelektrónovej mikroskopie. Rýchlo zmrazená tenká vrstva (asi 100 nm) vzorky tkaniva sa umiestni na mikroskopickú mriežku a skúma sa pod mikroskopom vo vákuu pri -160 °C.

Metóda elektrónovej mikroskopie "zmrazenie - leptanie" Používa sa na štúdium vonkajšieho povrchu bunkových membrán. Po rýchlom zmrazení buniek pri veľmi nízkej teplote sa blok rozštiepi čepeľou noža. Výsledné ľadové kryštály sa odstránia sublimáciou vody vo vákuu. Potom sa oblasti buniek zatienia naprašovaním tenkého filmu ťažkého kovu (napríklad platiny). Metóda umožňuje odhaliť trojrozmernú organizáciu štruktúr.

Metódy zmrazenia-štiepenia a zmrazenia-leptania teda umožňujú študovať nefixované bunky bez toho, aby sa v nich vytvárali fixáciou indukované artefakty.

Metódy kontrastu so soľami ťažkých kovov umožňujú študovať jednotlivé makromolekuly - DNA, veľké proteíny (napríklad myozín) v elektrónovom mikroskope. Pri negatívnom kontraste sa študujú agregáty makromolekúl (ribozómy, vírusy) alebo proteínových filamentov (aktínové filamenty).

Elektrónová mikroskopia ultratenkých rezov získaných kryoultramikrotómiou. Pri tejto metóde sa kúsky tkaniva bez fixácie a zaliatia do pevných médií rýchlo ochladia v tekutom dusíku pri teplote -196 °C. To poskytuje inhibíciu metabolických procesov buniek a prechodu vody z kvapalnej fázy do pevnej. Ďalej sa bloky režú na ultramikrotóme pri nízkej teplote. Táto metóda delenia sa zvyčajne používa na stanovenie aktivity enzýmov, ako aj na vykonávanie imunochemických reakcií. Na detekciu antigénov sa používajú protilátky spojené s časticami koloidného zlata, ktorých lokalizáciu je možné na prípravkoch ľahko identifikovať.

Metódy ultravysokonapäťovej mikroskopie. Používajú sa elektrónové mikroskopy s urýchľovacím napätím do 3 000 000 V. Výhodou týchto mikroskopov je, že umožňujú študovať objekty veľkej hrúbky (1-10 mikrónov), keďže pri vysokej energii elektrónov sú objektom menej absorbované. Stereoskopické zobrazovanie umožňuje získať informácie o trojrozmernej organizácii intracelulárnych štruktúr s vysokým rozlíšením (asi 0,5 nm).

Je veľmi ťažké poprieť význam vedy v živote celej spoločnosti. Vedci a ich vývoj dali spoločnosti všetko, čo ju teraz baví a teší. Vývoj vedcov v rôznych oblastiach umožňuje poraziť smrteľné choroby, bojovať proti duševným poruchám, vytvárať jedinečné „inteligentné“ zariadenia a dokonca aj roboty. Možnosti vedy sú skutočne nekonečné. Nové tváre so sebou vždy prinášajú nové nápady, ktoré sa stávajú základom budúceho vývoja. Mnohé vývojové trendy sú však založené na jednoduchých a overených metódach.

Mnohí mudrci z minulosti hovorili, že existuje makro-, mikrokozmos. V tomto štádiu vývoja si ľudia nedokázali uvedomiť celú hĺbku týchto slov. Koniec koncov, makro- a mikrokozmos skutočne existujú a veľmi úzko spolupôsobia. Drobné zmeny v štruktúre buniek môžu byť spôsobené globálnymi zmenami v slnečnej sústave. K dnešnému dňu je veľmi ťažké dokázať alebo vyvrátiť takýto vzťah, ale štúdie sveta baktérií a buniek naznačujú, že bunka je malý vesmír.

Mikroskopia

Mikroskopia je veda o používaní mikroskopu. V preklade z gréčtiny toto slovo znamená „malý, malý“. Mikroskopiu možno rozdeliť do niekoľkých poddruhov: optickú, multifotónovú, röntgenovú, laserovú a elektronickú. Účelom tejto metódy výskumu je zvýšiť pozorovanie objektu a registráciu zaznamenaných zmien.

História mikroskopu

Na začiatku svojho historického vývoja boli mikroskopy také, ktoré využívali viditeľné svetelné lúče. Takéto zariadenia boli na pozorovanie veľmi slabé a boli vhodné len na tie najjednoduchšie operácie. Myšlienka vzniku elektrónového mikroskopu vznikla v momente, keď vedci uvažovali o nahradení elektromagnetického žiarenia elektrónovým lúčom. Táto udalosť bola pre vývoj elektrónového mikroskopu, ktorý značne rozšíril možnosti pozorovania objektu.

Mikroskopické metódy

Aby bolo možné správne a dôkladne preskúmať akýkoľvek objekt, je potrebné pracovať podľa určitého algoritmu. Takéto algoritmy sa vyvíjajú raz a používajú sa roky. Aby sme mohli študovať svet okolo nás pomocou špeciálneho vybavenia, je potrebné ovládať špeciálne metódy. Mikroskopické metódy sú kombináciou rôznych algoritmov, pomocou ktorých je možné dôkladne a systematicky študovať konkrétny objekt mikrosveta. Prechod lúča svetla mikroskopom je sprevádzaný určitými zmenami v počiatočných charakteristikách, ktoré môžu byť spôsobené štruktúrnou štruktúrou objektu. Tento proces môže byť sprevádzaný radom optických efektov, ako je odraz, absorpcia, lom, disperzia atď.

Metódy svetelnej mikroskopie

Svetelná mikroskopia je systém metód, ktoré využívajú rôzne optické efekty na spoľahlivé zobrazenie výsledkov. Viditeľné prvky a povaha výsledného obrazu budú do značnej miery závisieť od osvetlenia. Celkovo existuje veľké množstvo mikroskopických metód: svetlé pole, šikmé osvetlenie, interferenčný kontrast, tmavé pole, polarizačná metóda, fázový kontrast, ultrafialová, luminiscenčná, infračervená mikroskopia, konfokálny mikroskop.

Všetky tieto metódy majú určité výhody a nevýhody. Pri práci so vzorkou by sa mala zvoliť jedna alebo druhá metóda na základe jej primeranosti v danej situácii. Silné a slabé stránky jednotlivých metód nie sú vo všeobecnosti dôležité, hlavné je, aby bola metóda použiteľná v daných podmienkach.

Mikroskopia a medicína

Využitie mikroskopie v medicíne má veľký potenciál. Dnes je možné vďaka mikroskopom skúmať rôzne bunky ľudského tela s cieľom presne určiť zdravotný stav. Bunky tela poskytujú najpresnejší a najspoľahlivejší výsledok, ktorý až donedávna nebolo možné získať, pretože mikroskopy nedokázali poskytnúť komplexné informácie.

Použitie takýchto zariadení je veľmi sľubné, pretože metódy liečby a diagnostiky sa môžu dramaticky zmeniť a úplne posunúť na novú úroveň. Výskum pomocou mikroskopov je známy a používaný už dlho, ale veda je na hranici liečby človeka bunkami. Toto je jedinečná príležitosť, ktorá vám umožní vzdialiť sa od bežných spôsobov liečby a zabudnúť na lieky. Bunka je najmocnejší prvok v tele. Je jednoducho zbytočné hovoriť o výhodách transplantácie zdravých buniek chorému človeku, pretože je to zrejmé.

Analýza moču

Všeobecná analýza moču je súbor opatrení, ktoré sú zamerané na štúdium vlastností moču a jeho fyzikálneho a chemického zloženia. Dôležitými ukazovateľmi sú v tomto prípade farba, vôňa, reakcia, priehľadnosť, hustota, ako aj obsah rôznych látok v moči. Mikroskopia sedimentu moču umožňuje určiť prítomnosť solí, bunkových prvkov a valcov. Treba si uvedomiť, že moč je konečným produktom činnosti obličiek, ktorý dokáže veľmi presne odrážať stav metabolických procesov a krvi v tele.

Analýza sedimentu moču

Mikroskopia moču vám umožňuje vytvoriť úplnejší obraz s úplným vyšetrením tela. Náter sa tiež často používa na obvyklú a diferenciálnu diagnostiku chorôb močových ciest a obličiek. Počas liečby môže byť predpísaná mikroskopia moču na vyhodnotenie účinnosti zásahu lekára. Analýza moču vám umožňuje identifikovať špecifické alebo potenciálne problémy v rovnováhe vody a elektrolytov v tele, ako aj v metabolickom procese. Rozbor moču je veľmi účinný pri diagnostike ochorení tráviaceho traktu, ako aj pri infekčných a zápalových procesoch v tele. Niekedy sa mikroskopia moču používa na sledovanie stavu pacienta počas obdobia terapeutickej alebo chirurgickej liečby.

Vyšetrenie krvi pod mikroskopom

Krvné bunky sa tvoria v červenej kostnej dreni a potom sa uvoľňujú do krvného obehu. Každý plní svoju špecifickú funkciu. Leukocyty sú potrebné na boj s infekčnými bunkami, erytrocyty prispievajú k obohateniu kyslíkových buniek a odstraňovaniu oxidu uhličitého z nich, krvné doštičky sú veľmi dôležité pre hemostázu. Za normálnych podmienok ľudské telo produkuje normatívnu hodnotu všetkých buniek, ktorá neprekračuje určité hranice. V prípade akýchkoľvek komplikácií alebo ochorení môžu krvinky zmeniť svoju veľkosť, tvar, farbu a množstvo. Len vďaka presnému mikroskopickému vyšetreniu je možné určiť stav buniek a vyvodiť príslušné závery.

Krv je životodarná tekutina tela, ktorá zabezpečuje výmenu užitočných látok medzi všetkými bunkami. Mikroskopia krvného náteru je vyšetrenie vykonávané pod mikroskopom. Študuje sa prípravok pripravený z jednej kvapky krvi. Tento postup je zahrnutý vo všeobecnom krvnom teste alebo leukocytovom vzorci a nevykonáva sa samostatne.

škvrnová mikroskopia

Čo je potrebné Mikroskopia krvného náteru dáva odborníkovi veľmi dôležité poznatky o stave ľudského zdravia. Pomocou tejto analýzy môžete určiť kvantitatívny pomer červených krviniek, krvných doštičiek, bielych krviniek, ako aj ich tvar a veľkosť. Okrem toho vám umožňuje určiť kvantitatívnu expresiu nezrelých leukocytov, čo je veľmi dôležitý bod pri mnohých ochoreniach. Krvný náter vám tiež umožňuje kvalitatívne diagnostikovať choroby, ktoré môžu súvisieť s poruchou funkcie krvi, jej tvorbou, koaguláciou a deštrukciou a tiež pri leukémii.

Krvný náter je predpísaný, ak všeobecný krvný test ukázal, že kvantitatívna expresia leukocytov, nezrelých alebo atypických buniek je zvýšená. Na náter môžete použiť biomateriál z krvi alebo kapilár.

Biológia a mikroskopy

Biológia značne rozširuje možnosti využitia mikroskopov. Ako už bolo spomenuté, cytológia sa vo veľkej miere spolieha na moderné a výkonné mikroskopy. Mikroskopia v biológii otvára vedcom nebývalý priestor pre experimenty a výskum. Moderný vývoj nám už umožňuje hovoriť o tom, čo nás čaká v budúcnosti.

Mikroskopia v biológii má veľmi široké uplatnenie. Prístroje nám umožňujú študovať organizmy, ktoré sú ľudskému oku nedostupné, no sú veľmi dôležité pre vedecké experimenty. V biológii je najčastejšie používaná metóda elektrónová mikroskopia, ktorá poskytuje obraz vďaka usmernenému toku elektrónov. Zároveň dokonca aj svetelný mikroskop umožňuje študovať živé biologické objekty.

Metóda mikroskopie v biológii sa používa veľmi aktívne, pretože takmer všetky odrody sú použiteľné na biologický výskum. Interferenčná mikroskopia umožňuje študovať priehľadné kvapaliny a predmety, ako aj ich kvalitatívnu analýzu. Je to možné vďaka skutočnosti, že svetelný lúč prechádzajúci zariadením sa rozdvojuje: jedna jeho časť prechádza objektom a druhá časť prechádza okolo. Tieto dva lúče sa teda vzájomne prelínajú a kombinujú, aby vytvorili úplný obraz.

Mikroskopia v rôznych oblastiach použitia

Rozsah mikroskopie je veľmi široký. Napriek tomu, že pôvodne boli mikroskopy určené na výskum v oblasti biológie, dnes sa sféra ich vplyvu výrazne rozšírila. Mikroskopia je súbor metód, ktoré našli svoje uplatnenie pri analýze pevných a kryštalických telies, štruktúry a štruktúr povrchov. Mikroskopy sa tiež aktívne používajú v medicíne nielen na diagnostiku, ale aj na vykonávanie mikrochirurgických operácií. Navyše je známe, že vedci vyvinuli podvodný laserový mikroskop, ktorého účelom je hľadať mimozemský život na Európe.

Netreba zabúdať ani na rýchly rozvoj nanotechnológií, ktoré sú nemysliteľné bez mikroskopov. Rozvoj tohto odvetvia vedie k tomu, že odrody mikrozariadení sa neustále zdokonaľujú. Okrem toho existujú nové, ktoré sú určené na štúdium určitého prostredia.

Ak zhrnieme niektoré výsledky, treba povedať, že mikroskopia je perspektívna oblasť, ktorá sa každým rokom rozvíja čoraz aktívnejšie. Záujem o ľudské kmeňové bunky, ako aj rozvoj nanotechnológií vedie k tomu, že mikroskopy sa stávajú neoddeliteľnou súčasťou akejkoľvek výskumnej práce.

Svetlo v závislosti od vlastností objektu mení svoje fyzikálne vlastnosti – farbu (vlnová dĺžka), jas (amplitúda vlny), fázu, ktoré sa využívajú v moderných mikroskopoch na vytváranie kontrastu.

Ryža. 1. Mikroskop MBI-3: 1 - noha, alebo topánka; 2 - jahňatá hrubého pohybu rúrky; 3 - držiak trubice; 4 - okuláre; 5 - binokulárny nástavec; 6 - hlava na pripevnenie revolvera so sedlom na výmenu trubíc; 7 - skrutka na pripevnenie ďalekohľadu; 8 - revolver na šmykľavke; 9 - šošovky; 10 - predmetová tabuľka; 11 - baránok pozdĺžneho pohybu držiaka lieku; 12 - baránok priečneho pohybu držiaka lieku; 13 - aplanatický kondenzor pre priame a šikmé osvetlenie; 14 - skrutky na centrovanie stola; 15 - hlava skrutky upevňujúca hornú časť javiska; 16 - držiak kondenzátora; 17 - jahňací mikromechanizmus; 18 - zrkadlo; 19 - krabica s mikromechanizmom.

Najľahšie prístupné farbeniu sú fixované, usmrtené prípravky. Takéto nehybné preparáty je možné s vysokou presnosťou skúmať a fotografovať cez mikroskop, ale neumožňujú hodnotiť rôzne formy životnej aktivity mikroskopického objektu (pohyb, fúzia, fagocytóza a pod.). Známe sú farbivá, ktoré sa viažu na živé bunky bez narušenia ich životných funkcií.

vitálny(vitálna) mikroskopia ukazuje, že mnohé štruktúry živých buniek sa šikovnou fixáciou a následným farbením menia relatívne málo. To potvrdzuje vysokú vedeckú hodnotu informácií získaných mikroskopovaním zafarbených predmetov. Vitálna mikroskopia je možná aj bez farbenia, ak sa do bežného mikroskopu zavedie takzvaný tmavý kondenzor. Osvetľuje objekt tak, že do oka pozorovateľa vstupujú len tie lúče, ktoré sú rozptýlené na časticiach objektu a tým menia smer svojho šírenia. Lúče, ktoré prechádzajú pozadím bez rozptylu, nevstupujú do oka. Preto častice objektu žiaria a jasne vystupujú na tmavom pozadí (tmavé pole). Častice objektu sú jasne viditeľné, aj keď sú ich rozmery menšie ako povolená vzdialenosť.

Darkfield mikroskopia poskytuje najväčší možný kontrast obrazu, ale jeho jasnosť a užitočné zväčšenie sú výrazne nižšie ako pri bežnej mikroskopii. Mikroskopia v tmavom poli sa úspešne používa na štúdium spirochét, leptospir a iných slabo sa sfarbujúcich mikroorganizmov. Pri práci s histologickými prípravkami nie je použiteľná.

Technicky nezávislá verzia mikroskopie v tmavom poli je ultramikroskopia, v ktorej sú najmenšie skúmané častice osvetlené silným bočným lúčom svetla a sú viditeľné ako bodky na čiernom pozadí. Ultramikroskopia umožňuje počítať častice, vyhodnocovať ich veľkosti a ďalšie vlastnosti. Používa sa na štúdium koloidných roztokov, aerosólov, suspenzií.

V posledných rokoch sa mikroskopia v tmavom poli využíva čoraz menej, pretože sa objavili dva nové typy kontrastných zariadení s výrazne lepšími charakteristikami - fázový kontrast (obr. 2, a a b) a mikroskop s amplitúdovým kontrastom. Technicky sú si podobné, no využívajú rôzne variácie svetelného lúča v objekte. Lúč prechádzajúci pozadím vzorky v ideálnom prípade nepodlieha žiadnym zmenám. Prechádza presne vymedzenými oblasťami šošovky. Lúč prechádzajúci objektom je vystavený difrakcii, t.j. rozpadá sa na lúče s klesajúcou intenzitou, ktoré opúšťajú objekt pod rôznymi uhlami. Ostatné vlastnosti lúča (amplitúda, vlnová dĺžka, fáza) sa menia v rôznej miere v závislosti od charakteristík objektu.

Ryža. Obr. 2. Mikroskop MBI-3 (a) s fázovo kontrastným zariadením KF-1 (b): 1 - kondenzor otočného systému; d - súbor šošoviek a prstencových membrán; 3 - pomocný mikroskop.

Takmer všetky živé mikroskopické objekty vyzerajú v bežnom mikroskope sotva viditeľné, priehľadné, pretože takmer nemenia ani amplitúdu, ani farbu lúča, ktorý nimi prešiel.

Menia len fázu jej vlnenia, no túto zmenu nezachytí ani oko, ani fotografická platňa. Lúč lúčov difraktovaný objektom a ním fázovo posunutý prechádza cez tie časti šošovky, kde priame, nedifraktované lúče pozadia nemôžu prechádzať. Je prakticky ľahké presne určiť, kam tieto lúče prejdú. Ak je táto oblasť pokrytá jednou zo šošoviek objektívu priesvitnou platňou schopnou meniť fázu, intenzitu, farbu alebo všetky tieto tri vlastnosti spolu, potom obrázok pozadia zmení fázu, zníži sa jeho jas, resp. farba sa zmení. Lúče, ktoré prešli objektom a boli ním vychýlené (difraktované), obídu platňu vloženú do šošovky, a preto nenadobudnú vlastnosti, ktoré nadobudli lúče pozadia po prechode platňou. V dôsledku toho sa rozdiel medzi lúčmi pozadia a objektu zväčší. Ak fázový rozdiel medzi lúčmi pozadia a predmetu dosiahne 1/4 vlnovej dĺžky, potom je na konečnom obrázku viditeľný kontrast pre oko a fotografickú platňu: tmavý predmet na svetlom pozadí alebo naopak, v závislosti od štruktúry dosky, ktorá sa v tomto prípade nazýva "fáza" . Ak platňa mení hlavne jas a farbu pozadia, potom by sa takýto mikroskop mal nazývať mikroskop s amplitúdovým kontrastom (rozšírenejší sa stal kratší, aj keď nie celkom správny názov „anoptral“). Rozdiel medzi mikroskopom s fázovým kontrastom a mikroskopom s amplitúdovým kontrastom je teda určený vlastnosťami platne v objektíve, ktorá mení vlastnosti nedifraktovaných lúčov pozadia. Obrázky vytvorené týmito mikroskopmi sú oveľa jasnejšie a bohatšie na detaily (obrázky 3 a 4) ako obrázky v tmavom poli.

Ryža. 3. Kultúra mnohobunkovej baktérie Caryophanon latum Peshkoff. Amplitúdová kontrastná mikroskopia.
Ryža. 4. Mikrokolónie vás. megatherium infikované fágom. Amplitúdová kontrastná mikroskopia.

S príchodom fázovo a amplitúdovo kontrastných mikroskopov získala vitálna mikroskopia výbornú technickú a metodickú základňu, ktorej možnosti sú pre svetelnú optiku takmer na hranici možností. Tieto zariadenia nevyžadujú žiadnu fixáciu alebo farbenie predmetu. Moderná vitálna mikroskopia výrazne rozšírila naše poznatky o správaní a dynamike živých mikroobjektov v prirodzených a laboratórnych podmienkach biotopu a experimentu. Zrýchlené (rýchle) a pomalé (časozberné) mikrofilmovanie dostupné pre výskumné procesy, ktorých prietok je príliš vysoký alebo príliš nízky na vizuálne pozorovanie.

Komerčne dostupné zariadenia s fázovým a amplitúdovým kontrastom (anoptral) sú lacné a možno ich jednoducho namontovať na komerčné mikroskopy; ich použitie nie je náročné. Tieto zariadenia nepochybne nájdu nové oblasti uplatnenia ako vo vedeckom výskume, tak aj v lekárskej praxi.

ultrafialová mikroskopia je založená na schopnosti niektorých látok selektívne absorbovať ultrafialové lúče s určitou vlnovou dĺžkou. To vám umožňuje vizuálne demonštrovať a študovať, a to aj kvantitatívne, distribúciu látok v živých bunkách alebo fixovaných prípravkoch. Takže napríklad proteíny a nukleové kyseliny sú pre viditeľné svetlo rovnako transparentné; pri pohľade na nezafarbenú bunku vo viditeľnom svetle nie je možné určiť, kde sa nachádza proteín alebo nukleová kyselina. Nukleová kyselina však absorbuje ultrafialové lúče určitej dĺžky oveľa silnejšie ako proteín. Preto v ultrafialovom mikroskope vyzerá oblasť obsahujúca nukleovú kyselinu oveľa tmavšia. Keďže ultrafialové lúče oko priamo nevníma, je potrebné použiť špeciálne meniče svetla. Ultrafialová mikroskopia je technicky oveľa zložitejšia ako bežná svetelná mikroskopia, jej vybavenie je drahšie a technika tenšia. Napriek tomu je jeho použitie opodstatnené, pretože vedecký význam rýchleho topografického opisu chemického zloženia živej bunky je veľmi vysoký.

Oveľa dostupnejšia a perspektívnejšia je luminiscenčná mikroskopia (pozri), ktorá je dnes široko používaná vo výskumných a klinických diagnostických laboratóriách. Zároveň je živý predmet ošetrený špeciálnymi farbivami, ktoré po osvetlení modrým, fialovým alebo ultrafialovým svetlom začnú žiariť a vyžarujú dlhšie vlnové dĺžky (zelená, žltá). Farba excitovanej sekundárnej žiary závisí od chemických vlastností predmetu a farbiva doň zavedeného.

Polarizačná mikroskopia je založená na zmene roviny kmitania svetelnej vlny po prechode kryštálmi. V praktickej medicíne sa nepoužíva.

Moderná mikroskopia vyžaduje použitie rôznych pomocných zariadení. Vyhrievacie stoly a termostaty umožňujú udržiavať a pozorovať objekt po dlhú dobu pri danej teplote. Na dlhodobú kultiváciu mikróbov alebo tkanivových kultúr sa v zornom poli silnej šošovky používajú rôzne mikrokamery. Okulárové a objektívové mikrometre umožňujú presné merania mikroobjektov. Priemysel vyrába mikromanipulátory (pozri) na operácie na mikroobjektoch. Na získanie stereoskopického obrazu pri až 100-násobnom zväčšení sú určené binokulárne lupy (pozri) a stereomikroskopy (obr. 5). Široko sa vyrábajú a používajú zariadenia na mikrofotografiu a mikrokinofilmovanie (obr. 6). Pozri tiež Mikroskopická technika.

Ryža. 5. Stereoskopický mikroskop MBS-1.

Ryža. 6. Inštalácia mikrofilmu MKU-1.

Mikroskopické metódy výskumu- spôsoby skúmania rôznych predmetov pomocou mikroskopu. V biológii a medicíne tieto metódy umožňujú študovať štruktúru mikroskopických objektov, ktorých rozmery presahujú rozlišovaciu schopnosť ľudského oka. Základom M.m.i. je svetelná a elektrónová mikroskopia. V praktickej a vedeckej činnosti lekári rôznych odborností - virológovia, mikrobiológovia, cytológovia, morfológovia, hematológovia atď., okrem klasickej svetelnej mikroskopie využívajú fázovo kontrastnú, interferenčnú, luminiscenčnú, polarizačnú, stereoskopickú, ultrafialovú, infračervenú mikroskopiu. Tieto metódy sú založené na rôznych vlastnostiach svetla. V elektrónovej mikroskopii vzniká obraz predmetov štúdia v dôsledku usmerneného toku elektrónov.

Pre svetelnú mikroskopiu a iné M.m.i. definovanie hodnoty okrem rozlíšenia mikroskop má povahu a smer svetelného lúča, ako aj vlastnosti skúmaného objektu, ktorý môže byť priehľadný a nepriehľadný. V závislosti od vlastností objektu sa menia fyzikálne vlastnosti svetla – jeho farba a jas súvisiaci s vlnovou dĺžkou a amplitúdou, fázou, rovinou a smerom šírenia vĺn. Na využití týchto vlastností svetla sú postavené rôzne M.m.i. Pre svetelnú mikroskopiu sa biologické objekty zvyčajne farbia, aby sa odhalila jedna alebo druhá z ich vlastností ( ryža. jeden ). V tomto prípade musia byť tkanivá fixované, pretože. farbenie odhalí určité štruktúry iba usmrtených buniek. V živej bunke je farbivo izolované v cytoplazme vo forme vakuoly a nefarbí jej štruktúru. Živé biologické objekty však možno študovať aj vo svetelnom mikroskope metódou vitálnej mikroskopie. V tomto prípade sa používa tmavý kondenzor, ktorý je zabudovaný v mikroskope.

ako v priečnom smere nastáva pozitívny dvojlom, pri spätných vzťahoch - negatívny dvojlom. Mnohé biologické objekty majú striktnú molekulárnu orientáciu, sú anizotropné a majú pozitívny dvojitý lom svetla. Takéto vlastnosti majú myofibrily, mihalnice ciliovaného epitelu, neurofibrily, kolagénové vlákna atď. ryža. 2 ). Polarizačná mikroskopia je jednou z histologické metódy výskumu, spôsobom mikrobiologická diagnostika, nájde uplatnenie v cytologické štúdie a iné.V tomto prípade je možné v polarizovanom svetle skúmať zafarbené aj nezafarbené a nefixované, takzvané natívne preparáty tkanivových rezov.

Fluorescenčná mikroskopia je široko používaná. Je založená na vlastnosti niektorých látok dávať luminiscenciu - luminiscenciu v UV lúčoch alebo v modrofialovej časti spektra. Mnohé biologické látky, ako sú jednoduché bielkoviny, koenzýmy, niektoré vitamíny a liečivá, majú svoju vlastnú (primárnu) luminiscenciu. Ostatné látky začnú žiariť až vtedy, keď sa k nim pridajú špeciálne farbivá – fluorochrómy (sekundárna luminiscencia). Fluorochrómy môžu byť v bunke distribuované difúzne alebo selektívne farbiť jednotlivé bunkové štruktúry alebo určité chemické zlúčeniny biologického objektu. Toto je základ pre použitie luminiscenčnej mikroskopie v cytologických a histochemických štúdiách (pozri. Metódy histochemického výskumu ). Pomocou imunofluorescencie vo fluorescenčnom mikroskope sa zisťujú vírusové antigény a ich koncentrácia v bunkách, identifikujú sa vírusy, stanovujú sa antigény a protilátky, hormóny, rôzne metabolické produkty a pod. ( ryža. 3 ). V tomto smere sa luminiscenčná mikroskopia využíva pri laboratórnej diagnostike infekcií ako sú vírusové a pod., využíva sa pri rýchlej diagnostike respiračných vírusových infekcií, pri skúmaní odtlačkov z nosovej sliznice pacientov a pri diferenciálnej diagnostike rôznych infekcií. V patomorfológii sa pomocou fluorescenčnej mikroskopie rozpoznávajú zhubné nádory v histologických a cytologických preparátoch,

určiť oblasti ischémie srdcového svalu v počiatočných štádiách infarktu myokardu, zistiť amyloid vo vzorkách tkanivovej biopsie atď.

Infračervená mikroskopia umožňuje študovať objekty, ktoré sú nepriehľadné pre viditeľné svetlo a UV žiarenie tým, že svojimi štruktúrami absorbuje svetlo s vlnovou dĺžkou 750-1200. nm. Pre infračervenú mikroskopiu nie je potrebné žiadne predbežné chemické ošetrenie vzoriek. Tento typ M.m.i. najčastejšie sa používa v zoológii, antropológii a iných odvetviach biológie. V medicíne sa infračervená mikroskopia používa najmä v neuromorfológii a oftalmológii.

Sekcie