domov
Črpalke in črpalna oprema
Nodulne bakterije se lahko asimilirajo. Nodulne bakterije so simbiotični organizmi, ki vežejo dušik.

Nodulne bakterije se lahko asimilirajo. Nodulne bakterije so simbiotični organizmi, ki vežejo dušik.

Nodulne bakterije so bile prva skupina mikrobov, ki vežejo dušik, znana človeštvu.

Pred približno 2000 leti so kmetje opazili, da pridelava stročnic povrne izčrpani zemlji rodovitnost. To posebno lastnost stročnic so empirično povezovali s prisotnostjo svojevrstnih gomoljev ali gomoljev na njihovih koreninah, vendar dolgo časa niso mogli pojasniti razlogov za ta pojav.

Potrebno je bilo veliko več raziskav, da bi dokazali vlogo stročnic in bakterij, ki živijo na njihovih koreninah, pri fiksaciji atmosferskega dušika. Toda postopoma se je z delom znanstvenikov iz različnih držav razkrila narava in podrobno preučila lastnosti teh čudovitih bitij.

Nodulne bakterije živijo s stročnicami v simbiozi, to pomeni, da si medsebojno koristijo: bakterije absorbirajo dušik iz atmosfere in ga pretvorijo v spojine, ki jih rastline lahko uporabljajo, te pa oskrbujejo bakterije s snovmi, ki vsebujejo ogljik, ki ga rane absorbirajo iz zraka v obliki ogljikovega dioksida.

Zunaj gomoljev na umetnih hranilnih gojiščih se gomoljne bakterije lahko razvijajo pri temperaturah od 0 do 35 °C, zanje pa so najugodnejše (optimalne) temperature reda 20–31 °C. Najboljši razvoj mikroorganizmov običajno opazimo v nevtralnem okolju (pri pH 6,5-7,2).

V večini primerov kisla reakcija tal negativno vpliva na vitalno aktivnost nodulnih bakterij, v takih tleh se oblikujejo neaktivne ali neučinkovite (ne fiksirajo dušika v zraku) rase le-teh.

Prvi raziskovalci nodulnih bakterij so domnevali, da se ti mikrobi lahko naselijo na koreninah večine vrst stročnic. Potem pa je bilo ugotovljeno, da imajo določeno specifičnost, imajo svoje "okuse" in "najemajo" prihodnje "stanovanjske prostore" v strogem skladu s svojimi potrebami. Ena ali druga rasa nodulnih bakterij lahko vstopi v simbiozo s stročnicami le določene vrste.

Trenutno so nodulne bakterije razdeljene v naslednje skupine (glede na gostiteljske rastline, na katerih se naselijo):

  • nodulne bakterije lucerne in sladke detelje;
  • nodulne bakterije detelje;
  • koreninske gomoljne bakterije graha, grašice, boba in krmnega fižola;
  • bakterije sojinih gomoljev;
  • nodulne bakterije volčjega boba in seradele;
  • gomoljične bakterije fižola;
  • nodulne bakterije arašidov, strnega graha, strnega graha itd.

Povedati je treba, da specifičnost nodulnih bakterij v različnih skupinah ni enaka. Izbirčni "najemniki" včasih izgubijo skrbnost. Medtem ko se gomoljne bakterije detelje odlikujejo po zelo strogi specifičnosti, tega ne moremo trditi za grahove nodične bakterije.

Sposobnost tvorbe vozličkov ni značilna za vse stročnice, čeprav je na splošno razširjena med predstavniki te ogromne družine. Od 12 tisoč vrst stročnic so jih posebej raziskali 1063. Izkazalo se je, da jih 133 ni moglo tvoriti vozličev.

Zdi se, da zmožnost simbioze s fiksatorji dušika ni edinstvena za stročnice, čeprav so edine pomembne rastline, ki vežejo dušik v kmetijstvu. Ugotovljeno je bilo, da atmosferski dušik vežejo bakterije, ki živijo v gomoljih na koreninah sesalca, rakitovca, pastirja, svetlečega bora, krapa, ježa, subtropskih rastlin iz rodu casuarina. Sposoben fiksiranja dušika in bakterij, ki živijo v vozliščih listov nekaterih tropskih grmovnic.

Fiksacijo dušika izvajajo tudi aktinomicete, ki živijo v gomoljih korenin jelše, in morda glive, ki živijo v koreninah ruše in nekaterih rastlin vresja.

Za kmetijstvo pa so seveda najbolj praktične zanimive stročnice. Večina omenjenih nestročnic nima kmetijske vrednosti.

Za prakso je zelo pomembno vprašanje: kako gomoljne bakterije živijo v zemlji, preden okužijo korenine?

Izkazalo se je, da lahko rhizobia ostane v tleh zelo dolgo v odsotnosti "gostiteljev" - stročnic. Vzemimo primer. V Moskovski kmetijski akademiji po imenu K. A. Timiryazev so polja, ki jih je postavil D. N. Pryanishnikov. Na njih se iz leta v leto pridelujejo iste kmetijske kulture in ohranja se trajna praha, na kateri že skoraj 50 let niso vzgajali rastlin. Analiza tal te prahe in polja trajne rži je pokazala, da so v njih gomoljne bakterije v znatnih količinah. Pod trajno ržjo jih je nekaj več kot v paru.

Posledično rizobije razmeroma dobro preživijo v odsotnosti stročnic in lahko zelo dolgo čakajo, da jih srečajo. Toda pod temi pogoji izgubijo svojo izjemno sposobnost popravljanja bunkerja. Vendar pa bakterije z "užitkom" prenehajo s svojim "prostim načinom življenja", takoj ko se jim na poti znajde primerna stročnica, takoj prodrejo v korenine in ustvarijo svoje hišice.

V kompleksnem procesu nastajanja vozličkov sodelujejo trije dejavniki: dva živa organizma - bakterije in rastline, med katerima se vzpostavijo tesni simbiotični odnosi, in okoljske razmere. Vsak od teh dejavnikov je aktiven udeleženec v procesu nastajanja vozličev.

Ena od pomembnih lastnosti nodulnih bakterij je njihova sposobnost izločanja tako imenovanih stimulativnih snovi; te snovi povzročijo hitro rast koreninskih tkiv.

Druga njihova bistvena lastnost je sposobnost prodiranja v korenine določenih rastlin in povzročanja tvorbe gomoljev, z drugimi besedami, njihova kužna sposobnost, ki je, kot že omenjeno, različna za različne rase gomoljnih bakterij.

Vloga stročnic pri nastajanju gomoljev je določena s sposobnostjo rastline, da izloča snovi, ki spodbujajo ali zavirajo razvoj bakterij.

Na dovzetnost stročnic za okužbo z nodulnimi bakterijami močno vpliva vsebnost ogljikovih hidratov in dušikovih snovi v njenih tkivih. Obilje ogljikovih hidratov v tkivih stročnic spodbuja nastanek vozličev, medtem ko povečanje vsebnosti dušika, nasprotno, zavira ta proces. Višje kot je torej razmerje C/N v rastlini, boljši je razvoj nodul.

Zanimivo je, da dušik, ki ga vsebujejo tkiva rastline, tako rekoč moti vnos "tujega" dušika.

Tretji dejavnik - zunanje razmere (osvetlitev, baterije itd.) prav tako pomembno vplivajo na nastanek vozličev.

Toda vrnimo se k karakterizaciji nekaterih vrst nodulnih bakterij.

Infekcijska sposobnost ali sposobnost tvorbe nodulov ne kaže vedno, kako aktivno nodulne bakterije vežejo atmosferski dušik. "Uspešnost" nodulnih bakterij pri fiksaciji dušika se pogosto imenuje njihova učinkovitost. Večja kot je učinkovitost, večja je učinkovitost teh bakterij, večja je njihova vrednost za rastlino in s tem za kmetijstvo nasploh.

V tleh najdemo vrste nodulnih bakterij, učinkovite, neučinkovite in prehodne med tema dvema skupinama. Okužba stročnic z učinkovito raso nodulnih bakterij spodbuja aktivno fiksacijo dušika. Neučinkovita dirka povzroči nastanek vozličev, vendar se v njih ne pojavi fiksacija dušika, zato se gradbeni material zapravlja zaman, rastlina hrani svoje "goste" zaman.

Ali obstajajo razlike med učinkovitimi in neučinkovitimi vrstami nodulnih bakterij? Doslej na umetnih hranilnih gojiščih takšnih razlik v obliki ali obnašanju niso našli. Toda noduli, ki jih tvorijo učinkovite in neučinkovite rase, kažejo nekatere razlike. Na primer, obstaja mnenje, da je učinkovitost povezana z obsegom koreninskih tkiv, okuženih z bakterijami (pri učinkovitih rasah je 4-6-krat večja kot pri neučinkovitih) in trajanjem delovanja teh tkiv. V tkivih, okuženih z učinkovitimi bakterijami, se vedno nahajajo bakteroidi in rdeč pigment, ki je povsem enak krvnemu hemoglobinu. Imenuje se leghemoglobin. Neučinkoviti nodusi imajo manjši volumen okuženega tkiva, nimajo leghemoglobina, bakteroidov ne zaznamo vedno in izgledajo drugače kot učinkoviti nodusi.

Te morfološke in biokemične razlike se uporabljajo za izolacijo učinkovitih ras nodulnih bakterij. Običajno so zelo učinkovite bakterije, izolirane iz velikih, dobro razvitih gomoljev rožnate barve.

Zgoraj je bilo že rečeno, da sta "delo" nodulnih bakterij in njegova "učinkovitost" odvisna od številnih zunanjih pogojev: temperature, kislosti okolja (pH), osvetlitve, oskrbe s kisikom, vsebnosti hranil v tleh itd.

Vpliv zunanjih pogojev na fiksacijo atmosferskega dušika z bakterijami koreninskih gomoljev lahko ponazorimo z več primeri. Torej pomembno vlogo pri učinkovitosti fiksacije dušika igra vsebnost nitratov in amonijevih soli v tleh. V začetnih fazah razvoja metuljnic in nastajanja nodulov prisotnost majhnih količin teh soli v tleh ugodno vpliva na simbiotsko združbo; kasneje pa enaka količina dušika (predvsem njegove nitratne oblike) zavira fiksacijo dušika.

Posledično bolj ko je zemlja bogata z dušikom, ki je na voljo rastlini, šibkejša je fiksacija dušika. Dušik, vsebovan v tleh, pa tudi v telesu rastline, tako rekoč preprečuje privabljanje novih delov iz ozračja. Med drugimi hranili ima molibden opazen vpliv na fiksacijo dušika. Ko se ta element dušika doda v tla, se ga nabere več. To je očitno razloženo z dejstvom, da je molibden del encimov, ki fiksirajo atmosferski dušik.

Trenutno je zanesljivo ugotovljeno, da se stročnice, gojene v tleh z nezadostno vsebnostjo molibdena, zadovoljivo razvijajo in tvorijo vozliče, vendar sploh ne absorbirajo atmosferskega dušika. Optimalna količina molibdena za učinkovito fiksacijo dušika je približno 100 g natrijevega molibdata na 1 ha.

Vloga stročnic pri izboljšanju rodovitnosti tal

Stročnice so torej zelo pomembne za izboljšanje rodovitnosti tal. Z kopičenjem dušika v tleh preprečujejo izčrpavanje njegovih zalog. Vloga stročnic je še posebej velika v primerih, ko se uporabljajo za zelena gnojila.

Kmetijce pa seveda zanima tudi kvantitativna stran. Koliko dušika lahko nakopičimo v tleh pri gojenju nekaterih stročnic? Koliko dušika ostane v tleh, če pridelek popolnoma odstranimo z njive ali če stročnice dišijo po zelenem gnoju?

Znano je, da lahko v primeru okužbe metuljnic z učinkovitimi gomoljnimi vrstami vežejo od 50 do 200 kg dušika na hektar posevka (odvisno od tal, podnebja, rastlinske vrste ipd.).

Po mnenju znanih francoskih znanstvenikov Pochona in De Bergaca stročnice v normalnih poljskih razmerah vežejo približno naslednje količine dušika (v kg / ha):

Koreninski ostanki enoletnih in trajnih stročnic v različnih pogojih gojenja in na različnih tleh vsebujejo različne količine dušika. V povprečju lucerna letno pusti v tleh okoli 100 kg dušika na hektar. Detelja in volčji bob lahko v tleh shranita okoli 80 kg vezanega dušika, enoletne metuljnice pustijo v tleh do 10-20 kg dušika na hektar. Ob upoštevanju površin, ki jih zasedajo stročnice v ZSSR, je sovjetski mikrobiolog E. N. Mišustin izračunal, da letno vrnejo približno 3,5 milijona ton dušika na polja naše države. Za primerjavo omenimo, da je naša celotna industrija leta 1961 proizvedla 0,8 milijona ton dušikovih gnojil, leta 1965 pa jih bo proizvedla 2,1 milijona ton.Tako zavzema dušik, ki ga stročnice črpajo iz zraka v simbiozi z bakterijami, vodilno mesto v dušiku. bilanca kmetijstva pri nas.


Razširjenost nodulnih bakterij v naravi

Nodulne bakterije so simbiotični organizmi, ki se širijo v tleh in spremljajo nekatere vrste stročnic. Po uničenju gomoljev celice nodulnih bakterij vstopijo v tla in začnejo obstajati na račun različnih organskih snovi, tako kot drugi mikroorganizmi v tleh. Skoraj vseprisotna porazdelitev nodulnih bakterij dokazuje njihovo visoko stopnjo prilagodljivosti različnim talnim in podnebnim razmeram, sposobnost vodenja simbiotskega in saprofitnega načina življenja.

Če shematiziramo trenutno razpoložljive podatke o razširjenosti nodulnih bakterij v naravi, lahko posplošimo naslednje.

V nedotaknjenih in obdelovalnih tleh so običajno v velikih količinah prisotne gomoljne bakterije tistih vrst stročnic, ki jih najdemo v divji flori ali pa jih na določenem območju gojimo že dlje časa. Noduličnih bakterij je vedno največ v rizosferi stročnic, nekoliko manj v rizosferi drugih vrst, malo pa jih je v tleh stran od korenin.

V tleh najdemo tako učinkovite kot neučinkovite nodulne bakterije. Obstaja veliko dokazov, da dolgotrajni saprofitski obstoj noduličnih bakterij, zlasti v tleh z neugodnimi lastnostmi (kisla, slana), vodi do zmanjšanja in celo izgube bakterijske aktivnosti.


riž. 1 - Nodule na koreninah jelše (po J. Beckingu)

Navzkrižna okužba različnih vrst stročnic pogosto vodi v naravi in ​​kmetijski praksi do pojava vozličev na koreninah, ki ne vežejo aktivno molekularnega dušika. To je praviloma odvisno od odsotnosti ustreznih vrst nodulnih bakterij v tleh.

Ta pojav je še posebej pogosto opažen pri uporabi novih vrst stročnic, ki so bodisi okužene z neučinkovitimi vrstami bakterij navzkrižnih skupin ali se razvijejo brez vozličev.

riž. 2 - Nodule na koreninah tribulusa (po O. Allenu)

Nodulne bakterije se uporabljajo za industrijsko proizvodnjo nitragina, ki se uporablja za tretiranje semen stročnic. Prvi jih je odkril M. S. Voronin leta 1866. Kasneje jih je M. V. Beyerink (1888) izoliral v čisti kulturi in podrobno proučili mikrobiologi in fiziologi. Bakterije vstopijo v korenine stročnic preko koreninskega dlaka in prodrejo v notranjo ovojnico korenine, v parenhim, ter povzročijo povečano delitev in razmnoževanje celic. Na koreninah se oblikujejo grdi izrastki, imenovani noduli ali nodule. Sprva bakterije absorbirajo hranila rastline in nekoliko zavirajo njeno rast. Potem, ko tkivo vozličkov raste, se med bakterijami in višjimi rastlinami vzpostavi simbioza. Bakterije od rastline prejemajo ogljikovo hrano (sladkor) in minerale, v zameno pa ji zagotavljajo dušikove spojine.

Nodulne bakterije se naselijo v tleh, razmnožijo in prodrejo v koreninske celice skozi luknjice v koreninskih dlakah stročnic. V celicah pride do povečanega razmnoževanja gomoličnih bakterij in vzporedno s tem do intenzivne delitve koreninskih celic, okuženih z nodusnimi bakterijami.

Nodulne bakterije oskrbujejo stročnico z dušikom. Rastlina izkoristi ta vezani dušik in oskrbuje nodulne bakterije z organsko snovjo, ki vsebuje ogljik, ki jo potrebujejo. Nodulne bakterije lahko kot vir ogljika uporabljajo različne sladkorje in alkohole.

Nodulne bakterije so mikroaerofili (razvijajo se ob majhnih količinah kisika v okolju), vendar imajo raje aerobne pogoje. Nodulne bakterije, ki so izšle iz okužbe, se še naprej razmnožujejo v tkivu gostitelja. Glavnina bakterij se namnoži v citoplazmi celice in ne v niti okužbe. Najintenzivneje se razvijajo, ko je reakcija tal blizu nevtralne. Zato je pri setvi stročnic na kislih tleh poleg inokulacije semen potrebno apnenje tal. Cepljenje brez apnenja zelo malo vpliva na pridelek in vsebnost beljakovin.

Nodulne bakterije lahko pod ugodnimi pogoji v eni sezoni akumulirajo do 200–300 kg/ha dušika.

Mlade nodulne bakterije v čisti kulturi na hranilnih medijih imajo običajno paličasto obliko (sl. 2, 3), velikost palic je približno 0 5 - 0 9 X 1 2 - 3 0 μm, mobilna, razmnožuje se z delitvijo

V tleh poleg nodulnih bakterij živijo tudi drugi mikroorganizmi, ki lahko asimilirajo prosti dušik iz zraka; ne živijo na koreninah rastlin, ampak v njihovi bližini. Vsa druga hranila, ki jih potrebujejo ti mikrobi, absorbirajo sami in ne na račun rastlinskih sokov, kot je značilno za gomoljne rastline. Azotobacter je najpomembnejši mikroorganizem, ki živi v tleh in je sposoben asimilirati atmosferski dušik. Te bakterije lahko živijo v ugodnih pogojih vlažnosti, dobrega pretoka zraka, primerne temperature in kislosti tal. Zahteve Azotobacterja do toplotnega režima in vlažnosti tal so približno enake zahtevam kulturnih rastlin, vendar je bolj občutljiva na kislost tal kot večina rastlin.



Paleontološki dokazi kažejo, da so bile nekatere rastline iz skupine Eucaesalpinioideae najstarejše stročnice, ki so imele nodule.


Pri sodobnih vrstah stročnic so na koreninah številnih predstavnikov družine Papilionaceae našli vozliče.


Filogenetsko primitivnejši predstavniki takšnih družin, kot so Caesalpiniaceae, Mimosaceae, v večini primerov ne tvorijo nodulov.


Od 13.000 vrst (550 rodov) stročnic je bila prisotnost gomoljev doslej ugotovljena le pri približno 1300 vrstah (243 rodov). Sem sodijo predvsem rastlinske vrste, ki se uporabljajo v kmetijstvu (več kot 200).


Po oblikovanju nodulov stročnice pridobijo sposobnost absorbiranja atmosferskega dušika. Lahko pa se hranijo z vezanimi oblikami dušika - amonijeve soli in dušikove kisline. Samo ena rastlina, Hedysarum coronarium, asimilira samo molekularni dušik. Zato brez nodulov v naravi ta rastlina ne obstaja.


Nodulne bakterije oskrbujejo stročnico z dušikom, ki se veže iz zraka. Rastline pa oskrbujejo bakterije s produkti presnove ogljikovih hidratov in mineralnimi solmi, ki jih potrebujejo za rast in razvoj.


Leta 1866 je slavni botanik in znanstvenik za tla M. S. Voronin videl najmanjša "telesa" v vozličih na koreninah stročnic. Voronin je za tisti čas postavil drzne predpostavke: nastanek vozličev je povezal z aktivnostjo bakterij, povečano delitev celic koreninskega tkiva pa z reakcijo rastline na bakterije, ki so prodrle v korenino.


20 let kasneje je nizozemski znanstvenik Beijerin izločil bakterije iz gomoljev graha, grašice, ličinke, fižola, seradele in lizike ter preučeval njihove lastnosti in preveril sposobnost okuženosti rastlin in povzročanja nastajanja gomoljev. Te mikroorganizme je poimenoval Bacillus radicicola. Ker bakterije, ki tvorijo spore, pripadajo rodu Bacillus, nodulne bakterije pa te sposobnosti nimajo, jih je A. Prazhmovsky preimenoval v Bacterium radicicola. B. Frank je predlagal bolj uspešno generično ime za nodulne bakterije - Rhizobium (iz grškega rhizo - koren, bio - življenje; življenje na koreninah). To ime se je uveljavilo in se še vedno uporablja v literaturi.


Za označevanje vrste nodulnih bakterij je običajno generičnemu imenu Rhizobium dodati izraz, ki ustreza latinskemu imenu rastlinske vrste, iz katerih gomoljev so izolirani in na katerih lahko tvorijo nodule. Na primer Rhizobium trifolii - gomoljne bakterije detelje, Rhizobium lupini - gomoljne bakterije volčjega boba itd. V primerih, ko so nodulne bakterije sposobne tvoriti gomolje na koreninah različnih vrst stročnic, tj. povzročiti tako imenovano navzkrižno okužbo, vrsta ime je kot skupno - odraža natanko to sposobnost "navzkrižnega okuževanja". Na primer, Rhizobium leguminosarum - gomoljne bakterije graha (Pisum), leče (Lens), vrst (Lathyrus).


Morfologija in fiziologija nodulnih bakterij. Za nodulne bakterije je značilna neverjetna raznolikost oblik - polimorfizem. Mnogi raziskovalci so na to opozorili pri proučevanju nodulnih bakterij v čisti kulturi v laboratorijskih pogojih in zemlji. Nodulne bakterije so lahko paličaste in ovalne. Med temi bakterijami so tudi filtrabilne oblike, L-oblike, kokoidno nepremični in mobilni organizmi.



Mlade nodulne bakterije v čisti kulturi na hranilnih medijih imajo običajno paličasto obliko (sl. 143, 2, 3), velikost palic je približno 0,5-0,9 X 1,2-3,0 mikronov, mobilne, pomnožene z delitvijo. V paličastih celicah nodulnih bakterij detelje opazimo delitev z ligacijo. S starostjo se lahko paličaste celice premaknejo v brstenje. Po Gramu se celice obarvajo negativno, njihova ultrafina struktura je značilna za gramnegativne bakterije (slika 143, 4).


Nodulne bakterije s staranjem izgubijo svojo mobilnost in preidejo v stanje tako imenovanih pasov. To ime so dobili zaradi izmenjave gostih in ohlapnih delov protoplazme v celicah. Progavost celic je dobro zaznavna, če jo gledamo pod svetlobnim mikroskopom po obdelavi celic z anilinskimi barvili. Gosti odseki protoplazme (pas) so obarvani slabše kot prostori med njimi. V luminiscentnem mikroskopu so pasovi svetlo zeleni, prostori med njimi ne svetijo in so videti temni (slika 143, 1). Pasovi se lahko nahajajo na sredini kletke ali na koncih. Zonalnost celic je vidna tudi na elektronskih difraktogramih, če preparata pred ogledom ne obdelamo s kontrastnimi sredstvi (slika 143, 3). Verjetno je s starostjo bakterijska celica napolnjena z maščobnimi vključki, ki ne zaznavajo barve in posledično povzročijo progasto celico. Faza "pasastih palic" je pred fazo nastajanja bakteroidov - nepravilno oblikovanih celic: odebeljenih, razvejanih, sferičnih, hruškastih in stekleničastih (slika 144). Izraz "bakteroidi" je leta 1885 v literaturo uvedel J. Brunhorst in ga uporabil za tvorbe nenavadne oblike, veliko večje od paličastih bakterijskih celic, ki jih najdemo v tkivih nodulov.


,


Bakteroidi vsebujejo več volutinskih zrnc in zanje je značilna večja vsebnost glikogena in maščob kot paličaste celice. Bakteroidi, ki rastejo v umetnih hranilnih medijih in nastajajo v tkivih nodulov, so fiziološko istega tipa. Menijo, da so bakteroidi oblike bakterij z nepopolnim procesom delitve. Z nepopolno delitvijo celic nodulnih bakterij nastanejo dihotomno razvejane oblike bakteroidov. Število bakteroidov narašča s staranjem kulture; njihov pojav olajšajo izčrpavanje hranilnega medija, kopičenje presnovnih produktov in vnos alkaloidov v medij.


V starih (dvomesečnih) kulturah nodulnih bakterij je z uporabo elektronskega mikroskopa mogoče prepoznati jasno opredeljene sferične tvorbe v številnih celicah (slika 145) - artrospore. Njihovo število v celicah se giblje od 1 do 5.



Nodulne bakterije različnih vrst stročnic rastejo na hranilnih gojiščih z različno hitrostjo. Hitro rastoče bakterije vključujejo rizobije graha, detelje, lucerne, krmnega fižola, grašice, leče, lubadarja, sladke detelje, triplata, fižola, čičerike in ptičje noge; do počasi rastočih nodulnih bakterij volčjega boba, soje, arašidov, seradele, mung fižola, kravjega fižola, esparzete, grebena. Popolnoma oblikovane kolonije hitro rastočih kultur lahko dobite 3.-4. dan inkubacije, kolonije počasi rastočih kultur - 7.-8.


Za hitro rastoče gomoljične bakterije je značilna peritrična razporeditev bičkov, medtem ko so počasi rastoče bakterije monotrihialne (tabela 42, 1-5).



Poleg bičkov se v celicah nodulnih bakterij pri gojenju na tekočih gojiščih tvorijo nitasti in kroglasti izrastki (tabeli 42, 43). Njihova dolžina doseže 8-10 mikronov. Običajno se nahajajo na površini celice peritrihialno, vsebujejo jih od 4 do 10 ali več na celico.


,


Kolonije hitro rastočih nodulnih bakterij imajo barvo pečenega mleka, pogosto prosojne, sluzaste, z gladkimi robovi, zmerno konveksne in sčasoma rastejo na površini agarnega medija. Kolonije počasi rastočih bakterij so bolj konveksne, majhne, ​​suhe, goste in praviloma ne rastejo na površini gojišča. Sluz, ki jo proizvajajo nodulne bakterije, je kompleksna spojina polisaharidnega tipa, ki vključuje heksoze, pentoze in uronske kisline.


Nodulne bakterije so mikroaerofili (razvijajo se ob majhnih količinah kisika v okolju), vendar imajo raje aerobne pogoje.


Nodulne bakterije kot vir ogljika v hranilnih medijih uporabljajo ogljikove hidrate in organske kisline, kot vir dušika pa različne mineralne in organske spojine, ki vsebujejo dušik. Pri gojenju na gojiščih z visoko vsebnostjo snovi, ki vsebujejo dušik, lahko nodulne bakterije izgubijo sposobnost prodiranja v rastlino in tvorjenja nodulov. Zato gomoljne bakterije običajno gojimo na rastlinskih izvlečkih (fižolova, grahova juha) ali izvlečkih zemlje. Fosfor, potreben za razvoj, lahko pridobijo nodulne bakterije iz mineralnih in organskih spojin, ki vsebujejo fosfor; mineralne spojine lahko služijo kot vir kalcija, kalija in drugih mineralnih elementov.


Za zatiranje tuje saprofitne mikroflore pri izolaciji nodulnih bakterij iz nodulov ali neposredno iz tal priporočamo hranilne medije z dodatkom kristalne vijolice, tanina ali antibiotikov.


Za razvoj večine kultur nodulnih bakterij je potrebna optimalna temperatura v območju 24-26 °. Pri 0° in 37°C se rast ustavi. Običajno se kulture nodulnih bakterij hranijo v laboratorijskih pogojih pri nizkih temperaturah (2-4 °C).


Številne vrste nodulnih bakterij so sposobne sintetizirati vitamine B, pa tudi rastne snovi, kot je heteroavksin (-indolocetna kislina).


Vse gomoljne bakterije so približno enako odporne na alkalno reakcijo gojišča (pH = 8,0), vendar neenakomerno občutljive na kislo.


Specifičnost, virulentnost, kompetitivnost in aktivnost nodulnih bakterij.


koncept specifičnost nodulne bakterije – kolektivne. Označuje sposobnost bakterij, da tvorijo gomolje v rastlinah. Če govorimo o nodulnih bakterijah na splošno, potem je zanje nastajanje nodulov samo v skupini stročnic že samo po sebi specifično - imajo selektivnost za stročnice.


Če pa upoštevamo posamezne kulture gomoljnih bakterij, se izkaže, da so med njimi tudi takšne, ki so sposobne okužiti le določeno, včasih večjo, včasih manjšo skupino stročnic, in v tem smislu je specifičnost nodialnih bakterij. je selektivna sposobnost glede na gostiteljsko rastlino. Specifičnost gomoljnih bakterij je lahko ozka (deteljne gomoljne bakterije okužijo le skupino detelj – vrstna specifičnost, gomoljne bakterije volčjega boba pa so lahko označene celo s sortno specifičnostjo – okužijo le alkaloidne ali brezalkaloidne sorte volčjega boba). S široko specifičnostjo lahko grahove nodulne bakterije okužijo rastline graha, brade in fižola, grahove in fižolove nodulne bakterije pa lahko okužijo rastline graha, kar pomeni, da je za vse značilna sposobnost "navzkrižne okužbe". Specifičnost nodulnih bakterij je osnova za njihovo razvrstitev.


Posebnost nodulnih bakterij je nastala kot posledica njihove dolgotrajne prilagoditve na eno rastlino ali skupino le-teh in genetskega prenosa te lastnosti. V zvezi s tem obstaja tudi različna prilagodljivost nodulnih bakterij rastlinam znotraj skupine navzkrižne okužbe. Tako lahko gomoljne bakterije lucerne tvorijo gomolje v sladki detelji. Kljub temu so bolj prilagojene na lucerno, na sladko deteljo pa so bolj prilagojene bakterije sladke detelje.


V procesu okužbe koreninskega sistema stročnic z nodulnimi bakterijami je zelo pomembno virulentnost mikroorganizmi. Če specifičnost določa spekter delovanja bakterij, potem virulentnost nodulnih bakterij označuje aktivnost njihovega delovanja znotraj tega spektra. Virulenca se nanaša na sposobnost nodulnih bakterij, da prodrejo v koreninsko tkivo, se tam razmnožijo in povzročijo nastanek nodulov.


Pomembno vlogo igra ne le sama sposobnost prodiranja v korenine rastline, ampak tudi hitrost tega prodiranja.


Za določitev virulence seva nodulnih bakterij je treba ugotoviti njegovo sposobnost, da povzroči nastanek nodulov. Merilo za virulentnost katerega koli seva je lahko najmanjše število bakterij, ki zagotavlja močnejšo okužbo korenin v primerjavi z drugimi sevi, ki se zaključi z nastankom nodulov.


V prsti v prisotnosti drugih sevov bolj virulentni sev ne bo vedno prvi okužil rastline. V tem primeru je treba upoštevati konkurenčna sposobnost, ki pogosto prikrije lastnost virulence v naravnih razmerah.


Nujno je, da imajo virulentni sevi tudi konkurenčnost, tj. da lahko uspešno tekmujejo ne le s predstavniki lokalne saprofitske mikroflore, temveč tudi z drugimi sevi nodulnih bakterij. Indikator konkurenčnosti seva je število nodulov, ki jih tvori kot odstotek skupnega števila nodulov na rastlinskih koreninah.


Pomembna lastnost nodulnih bakterij je njihova dejavnost(učinkovitost), to je zmožnost asimilacije molekularnega dušika v sožitju s stročnicami in zadovoljevanja potreb gostiteljske rastline v njem. Glede na to, v kolikšni meri gomoljne bakterije prispevajo k povečanju pridelka metuljnic (slika 146), jih običajno delimo na aktivne (učinkovite), neaktivne (neučinkovite) in neaktivne (neučinkovite).



Sev bakterij, neaktiven za eno gostiteljsko rastlino v simbiozi z drugo vrsto stročnic, je lahko zelo učinkovit. Zato je treba pri karakterizaciji seva glede na učinkovitost vedno navesti, v zvezi s katero gostiteljsko rastlinsko vrsto se njegov učinek kaže.


Dejavnost nodulnih bakterij ni njihova trajna last. V laboratorijski praksi pogosto pride do izgube aktivnosti v kulturah nodulnih bakterij. V tem primeru se bodisi izgubi aktivnost celotne kulture bodisi se pojavijo posamezne celice z nizko aktivnostjo. Zmanjšanje aktivnosti nodulnih bakterij se pojavi v prisotnosti nekaterih antibiotikov, aminokislin. Eden od razlogov za izgubo aktivnosti nodulnih bakterij je lahko vpliv faga. S pasažo, to je večkratnim prehajanjem bakterij skozi gostiteljsko rastlino (prilagajanje na posamezno rastlinsko vrsto), je mogoče iz neučinkovitih pridobiti učinkovite seve.


Izpostavljenost y-žarkom omogoča pridobivanje sevov z večjo učinkovitostjo. Znani so primeri nastanka visoko aktivnih radiomutantov nodulnih bakterij lucerne iz neaktivnega seva. Uporaba ionizirajočega sevanja, ki neposredno vpliva na spremembo genetskih lastnosti celice, je po vsej verjetnosti lahko obetavna tehnika pri selekciji visoko aktivnih sevov gomoljičnih bakterij.


Okužba metuljnice z nodulnimi bakterijami.


Za zagotovitev normalnega procesa okužbe koreninskega sistema z nodulnimi bakterijami je potrebno v koreninskem območju imeti precej veliko število sposobnih bakterijskih celic. Mnenja raziskovalcev glede števila potrebnih celic za zagotovitev procesa cepljenja so različna. Tako je po podatkih ameriškega znanstvenika O. Allena (1966) za inokulacijo drobnosemenskih rastlin potrebno 500-1000 celic, pri velikosemenskih rastlinah pa vsaj 70.000 celic na 1 seme. Po mnenju avstralskega raziskovalca J. Vincenta (1966) mora vsako seme v trenutku inokulacije vsebovati vsaj nekaj sto sposobnih in aktivnih celic nodulnih bakterij. Obstajajo dokazi, da lahko posamezne celice prodrejo tudi v koreninsko tkivo.


Med razvojem koreninskega sistema metuljnice spodbujajo razmnoževanje gomoljnih bakterij na površini korenin s koreninskimi izločki. Produkti uničenja koreninskih klobukov in laskov imajo tudi pomembno vlogo pri zagotavljanju gomoličnih bakterij primernega substrata.


V rizosferi stročnic je razvoj nodulnih bakterij močno stimuliran, pri žitnih rastlinah pa tega pojava ne opazimo.


Na površini korenine je plast sluzaste snovi (matriks), ki nastane ne glede na prisotnost bakterij v rizosferi. Ta plast je jasno vidna, če jo pregledamo s svetlobno-optičnim mikroskopom (slika 147). Nodulne bakterije po inokulaciji običajno hitijo v to plast in se v njej kopičijo (slika 148) zaradi stimulativnega učinka korenine, ki se pokaže že na razdalji do 30 mm.


,


V tem obdobju, pred vnosom nodulnih bakterij v koreninsko tkivo, so bakterije v rizosferi izjemno mobilne. V zgodnjih študijah, v katerih so za raziskave uporabljali svetlobni mikroskop, so nodulne bakterije, ki se nahajajo v coni rizosfere, poimenovali schwermerji (gonidije ali zoospore) – »rojilne«. Z metodo Faereusa (1957) je mogoče opazovati nastajanje izjemno hitro premikajočih se kolonij švermerjev v predelu koreninskega vrha in koreninskih dlak. Schwermerjeve kolonije obstajajo zelo kratek čas - manj kot en dan.


O mehanizmu penetracije nodulnih bakterij v korenini rastline obstaja več hipotez. Najbolj zanimivi med njimi so naslednji. Avtorji ene izmed hipotez navajajo, da gomoljne bakterije prodrejo v korenino s poškodbo epidermalnega in kortikalnega tkiva (zlasti na mestih, kjer se stranske korenine odcepijo). To hipotezo je postavil na podlagi raziskav Bril (1888), ki je povzročil nastanek gomoljev pri metuljnicah tako, da je korenine prebodel z iglo, ki je bila predhodno potopljena v suspenzijo gomoljnih bakterij. Kot poseben primer je takšna pot izvajanja povsem realna. Na primer, pri arašidu se noduli nahajajo pretežno v pazduhah koreninskih vej, kar kaže na prodiranje nodulnih bakterij v korenino skozi vrzeli med kalitvijo stranskih korenin.


Zanimiva in ne neutemeljena hipoteza je prodiranje nodulnih bakterij v koreninsko tkivo skozi koreninske laske. Večina raziskovalcev priznava prehod nodulnih bakterij skozi koreninske laske.


Predlog P. Darta in F. Mercerja (1965) je zelo prepričljiv, da nodulne bakterije prodrejo v korenino v obliki majhnih (0,1-0,4 µm) kokoidnih celic skozi intervale (0,3-0,4 µm) celulozne fibrilarne mreže primarni ovoj koreninskih laskov. To stališče potrjujejo elektronske mikroskopske fotografije (slika 149) površine korenin, pridobljene z metodo replike, in dejstvo krčenja celic nodulnih bakterij v rizosferi stročnic.



Možno je, da gomoljne bakterije prodrejo v korenino skozi epidermalne celice mladih koreninskih vršičkov. Prazhmovsky (1889) lahko bakterije prodrejo v korenino le skozi mlado celično membrano (koreninski lasje ali epidermalne celice) in popolnoma ne morejo premagati kemično spremenjene ali plutaste plasti skorje. To lahko pojasni, da se noduli običajno razvijejo na mladih delih glavne korenine in nastajajočih stranskih koreninah.


V zadnjem času je hipoteza o avksinu postala zelo priljubljena. Avtorji te hipoteze verjamejo, da nodulne bakterije prodrejo v korenino zaradi stimulacije sinteze β-indoloocetne kisline (heteroavksina) iz triptofana, ki je vedno prisoten v rastlinskih koreninskih izločkih.Prisotnost heteroavksina je povezana z ukrivljenostjo koreninskih laskov. , kar običajno opazimo, ko je koreninski sistem okužen z nodulnimi bakterijami (slika 150).



Vir β-indolilocetne kisline v času okužbe rastline očitno niso le rastline, ki skozi koreninski sistem izločajo triptofan, ki ga številne vrste bakterij, vključno s koreninskimi gomolji, lahko pretvorijo v β-indolilocetno kislino. Pri sintezi heteroauksina lahko sodelujejo tudi same nodulne bakterije in morda druge vrste talnih mikroorganizmov, ki živijo v območju korenin.


Vendar avksinske hipoteze ni mogoče brezpogojno sprejeti. Delovanje heteroavksina je nespecifično in povzroča ukrivljenost koreninskih dlačic pri različnih vrstah rastlin, ne le pri metuljnicah. Hkrati nodulne bakterije povzročajo ukrivljenost koreninskih dlačic le pri stročnicah, medtem ko kažejo precejšnjo selektivnost. Če bi obravnavani učinek določal samo β-indolilocetna kislina, te specifičnosti ne bi bilo. Poleg tega je narava sprememb koreninskih dlak pod vplivom nodulnih bakterij nekoliko drugačna kot pod vplivom heteroauksina.


Prav tako je treba opozoriti, da so v nekaterih primerih neukrivljene koreninske dlake izpostavljene okužbi. Opazovanja kažejo, da je pri lucerni in grahu 60-70% koreninskih las zvitih in zvitih, pri detelji pa približno 50%. Pri nekaterih vrstah detelje je ta reakcija opažena pri največ 1/4 okuženih las. Pri reakciji ukrivljenosti je seveda zelo pomembno stanje koreninskega lasu. Rastoče koreninske dlake so najbolj občutljive na delovanje snovi, ki jih proizvajajo bakterije.


Znano je, da nodulne bakterije povzročajo mehčanje sten koreninskih laskov. Ne tvorijo pa niti celulaze niti pektinolitičnih encimov. V zvezi s tem je bilo predlagano, da nodulne bakterije prodrejo v korenino zaradi izločanja sluzi polisaharidne narave, ki povzroči sintezo encima poligalakturonaze ​​v rastlinah. Ta encim, ki uničuje pektinske snovi, vpliva na lupino koreninskih las, zaradi česar je bolj plastična in prepustna. V majhnih količinah je poligalakturonaza vedno prisotna v koreninskih dlačicah in, očitno, povzroča delno raztapljanje ustreznih komponent membrane, omogoča celici, da se razteza.


Nekateri raziskovalci menijo, da gomoljne bakterije prodrejo v korenino zaradi satelitskih bakterij, ki proizvajajo pektinolitične encime. Ta hipoteza je bila postavljena na podlagi naslednjih dejstev. Pri mikroskopiranju koreninskih dlak so številni raziskovalci opazili prisotnost svetlobne točke, v bližini katere se kopičijo gomoljne bakterije. Ta pega je lahko znak začetka maceracije (uničenja) tkiva s protopektinazo, podobno kot isti znak, ki ga opazimo pri rastlinah pri številnih bakterijskih boleznih. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da lahko avirulentne kulture nodulnih bakterij v prisotnosti bakterij, ki proizvajajo pektinolitične encime, prodrejo v korenino.


Opozoriti je treba še na eno hipotezo, po kateri nodulne bakterije vstopijo v korenino med tvorbo prstaste štrline na površini koreninskega dlaka. Elektronski difraktogram odseka koreninskega dlaka, ki potrjuje to hipotezo (sl. 150, 3), kaže koreninski dlak, upognjen v obliki ročaja dežnika, v pregibu katerega se kopičijo gomoljne bakterije. Nodulne bakterije so kot da jih koreninski lasek vleče (pogoltne) (podobno kot pinocitoza).



Hipoteze o invaginaciji v bistvu ni mogoče ločiti od avksinske ali encimske hipoteze, saj do invaginacije pride kot posledica izpostavljenosti avksinu ali encimskemu faktorju.


Proces vnosa gomoljnih bakterij v koreninsko tkivo je pri vseh vrstah stročnic enak in je sestavljen iz dveh faz. V prvi fazi pride do okužbe koreninskih laskov. V drugi fazi se intenzivno nadaljuje proces nastajanja vozličev. Trajanje faz je različno pri različnih rastlinskih vrstah: pri Trifolium fragiferum prva faza traja 6 dni, pri Trifolium nigrescens - 3 dni.


V nekaterih primerih je zelo težko zaznati meje med fazami. Najintenzivnejši vnos nodulnih bakterij v koreninske dlake se zgodi v zgodnjih fazah razvoja rastline. Druga faza se konča med množično tvorbo nodul. Pogosto se prodiranje noduličnih bakterij v koreninske dlake nadaljuje tudi po tem, ko so na koreninah že nastali vozliči. Do te tako imenovane ekscesne ali dodatne okužbe pride, ker se okužba dlak ne ustavi dolgo časa. V kasnejših fazah okužbe so gomolji običajno nameščeni nižje ob korenini.


Vrsta razvoja, zgradba in gostota koreninskih dlak ne vplivajo na hitrost vnosa nodulnih bakterij. Mesta nastanka nodulov niso vedno povezana z lokacijami okuženih las.


Ko prodrejo v koren (skozi koreninske dlake, epidermalne celice, mesta poškodb korenin), se nodulne bakterije nato premaknejo v tkiva korenine rastline. Najlažje bakterije prehajajo skozi medcelične prostore.


V koreninsko tkivo lahko prodre ena sama celica ali skupina bakterijskih celic. Če je bila vnesena ločena celica, se lahko še naprej premika skozi tkivo kot ena sama celica. Za rastline volčjega boba je značilen način okužbe korenin s posameznimi celicami.


Vendar pa v večini primerov invazivna celica, ki se aktivno razmnožuje, tvori tako imenovane infekcijske niti (ali infekcijske vrvice) in se že v obliki takih niti premakne v rastlinska tkiva.


Izraz "infekcijska nit" je nastal na podlagi preučevanja procesa okužbe v svetlobnem mikroskopu. Začenši z Beijerinckovim delom so na nit okužbe začeli gledati kot na sluzasto, hifam podobno maso, ki vsebuje proliferirajoče bakterije.


V bistvu je nit okužbe kolonija pomnoženih bakterij. Njen začetek je mesto, kamor je prodrla posamezna celica ali skupina celic. Možno je, da se na površini korenine začne tvoriti kolonija bakterij (in posledično bodoča infekcijska nit) še pred vnosom bakterij v korenino.


Število okuženih koreninskih laskov se med posameznimi rastlinami precej razlikuje. Običajno se nalezljive niti pojavijo v deformiranih, zvitih koreninskih dlakah. Vendar pa obstajajo znaki, da se podobne niti včasih nahajajo v ravnih laseh. Pogosteje opazimo eno razvejano nit v koreninskih dlakah, manj pogosto dve. V nekaterih primerih je v eni koreninski dlaki več niti ali pa so v večih skupne niti okužbe, ki povzročijo en nodul (slika 151).



Delež okuženih koreninskih las v skupnem številu deformiranih las je neznansko nizek. Običajno se giblje od 0,6 do 3,2, občasno doseže 8,0. Delež uspešnih okužb je še nižji, saj je med kužnimi nitmi veliko (do 80 %) tako imenovanih abortivnih nitk, ki so se prenehale razvijati. Hitrost napredovanja normalno razvijajočih se infekcijskih niti v rastlini je 5-8 mikronov na uro. Pri tej hitrosti lahko pot skozi koreninsko dlako, dolgo 100-200 mikronov, preide skozi nit okužbe v enem dnevu.


Morfološke in anatomske značilnosti nodulov v njihovi ontogenezi.


Glede na način nastanka so nodule stročnic razdeljene na dve vrsti:


Tip 1 - noduli nastanejo med delitvijo pericikličnih celic (koreninski sloj), običajno se nahajajo proti protoksilemu (prvi v času za nastanek žil) - endogeni tip tvorbe nodulov;


Tip 2 - vozliči izvirajo iz koreninske skorje kot posledica vnosa patogena v parenhimske celice skorje in endoderme (notranja plast primarne skorje) - eksogeni tip tvorbe vozličev.


V naravi prevladuje slednji tip. Tkiva osrednjega cilindra korenine sodelujejo samo pri tvorbi vaskularnega sistema vozličev tako endogenih kot eksogenih vrst.


Kljub različnim pogledom na naravo izvora nodul ekso- in endotipov je proces njihovega razvoja v bistvu enak. Vendar pa ne ene ne druge vrste nastajanja nodulov v nobenem primeru ne smemo identificirati s procesom nastajanja stranskih korenin, kljub dejstvu, da obstajajo nekatere podobnosti v njihovem nastanku. Tako nastajanje nodulov in stranskih korenin poteka hkrati in poleg tega v istem območju korenin.


Hkrati pa številne značilnosti v razvoju stranskih korenin in nodulov poudarjajo globoke razlike v vrsti njihove tvorbe. V periciklu nastanejo stranske korenine. Že od prvih trenutkov razvoja so povezani z osrednjim valjem glavne korenine, iz katerega se odcepijo osrednji valji stranskih korenin, in vedno nastajajo proti žarku primarnega lesa. Nastanek vozliča je v nasprotju s stransko korenino možen kjerkoli. Na samem začetku nastajanja nodulnega tkiva ni žilne povezave z osrednjim valjem korenine, nastane kasneje. Žile se običajno oblikujejo vzdolž oboda nodula. Povezani so s koreninskimi žilami preko traheidnega območja in imajo svoj endoderm (slika 152).



Razlika v naravi tvorbe vozličev in stranskih korenin je še posebej jasno opazna pri Seradelli, saj je kortikalno tkivo glavne korenine te rastline - mesto prvih vozličev - sestavljeno iz relativno majhne plasti celic in vozliči postanejo vidni zelo hitro po okužbi korenine z bakterijami. Na korenini najprej tvorijo sploščene izrastke, po katerih jih je mogoče razlikovati od stožčastih izrastkov stranskih korenin. Nodule se od stranskih korenin razlikujejo po številnih anatomskih značilnostih: odsotnosti osrednjega valja, koreninskih pokrovčkov in povrhnjice ter prisotnosti znatne plasti lubja, ki pokriva vozlič.



Nastajanje nodulov (sl. 153, 1, 2) stročnic se pojavi v obdobju, ko ima korenina še primarno strukturo. Začne se z delitvijo kortikalnih celic, ki se nahajajo na razdalji 2-3 plasti od koncev nalezljivih niti. Plasti skorje, ki jih prodrejo nalezljive niti, ostanejo nespremenjene. Hkrati se pri seradeli delitev kortikalnih celic pojavi neposredno pod okuženo koreninsko dlako, medtem ko pri grahu opazimo delitev celic le v predzadnji plasti skorje.


Delitev s tvorbo radialne strukture tkiva se nadaljuje do celic notranjega jedra. Pojavi se brez določene smeri, naključno, zaradi česar nastane meristem (sistem izobraževalnih tkiv) nodula, sestavljen iz majhnih zrnatih celic.


Razdeljene celice korteksa se spremenijo: jedra se zaokrožijo in povečajo, zlasti nukleoli. Po mitozi se jedra razpršijo in se začnejo znova deliti, ne da bi prevzela prvotno obliko.


Pojavi se sekundarni meristem. Kmalu se v endodermu in periciklu pojavijo znaki začetne delitve, ki v nekdanjih zunanjih celicah poteka predvsem s tangencialnimi septumi. Ta delitev se končno razširi na skupni meristematski kompleks, katerega majhne celice se podaljšajo, vakuole izginejo in jedro zapolni večino celice. Nastane tako imenovani primarni nodul, v plazmi celic katerega ni nodulnih bakterij, saj so na tej stopnji še vedno znotraj infekcijskih niti. Medtem ko nastaja primarni vozlič, se infekcijske niti večkrat razvejajo in lahko prehajajo med celicami - medcelično (slika 154) ali skozi celice - intracelularno - in vnesejo bakterije (slika 155).


,


Medcelične nalezljive niti zaradi aktivnega razmnoževanja nodulnih bakterij v njih pogosto pridobijo bizarno obliko - tvorijo se v obliki žepov (divertikulov) ali bakel (glej sliko 154).



Proces premikanja okužbenih niti od celice do celice ni povsem jasen. Očitno se nalezljive niti, kot meni kanadski mikrobiolog D. Jordan (1963), v obliki golih sluzastih pramenov sprehajajo po medceličnih prostorih rastlinskega tkiva, dokler se zaradi še vedno nerazložljivih razlogov ne začnejo invaginirati v citoplazmo sosednjih tkiv. celice.


V nekaterih primerih pride do invaginacije okužbe v eni, v nekaterih primerih v vsaki sosednji celici. Skozi te invaginirane cevaste votline (divertikule) teče vsebina nitke, obdane s sluzom. Najbolj aktivna rast kužnih niti se običajno pojavi v bližini jedra rastlinske celice. Prodiranje nitke spremlja gibanje jedra, ki se premika proti mestu okužbe, se povečuje, spreminja obliko in degenerira. Podobno sliko opazimo pri glivični okužbi, ko je jedro pogosto

0

Razvoj simbiotskih združb med metuljnicami in nodulnimi bakterijami je zelo zanimiv za agronomijo. Te simbioze zagotavljajo večino biološko vezanega dušika, ki je na voljo pridelkom.

Nodulne bakterije so dokaj pogosti gram-negativni mikroorganizmi, združeni v isto družino z znano fitopatogeno bakterijo Agrobacterium. Čeprav so nodulne bakterije v tem članku obravnavane izključno z vidika njihove vloge v simbiotskih odnosih z rastlinami, se je treba vedno zavedati, da so zelo dobro prilagojene na dolgoročno preživetje v tleh tudi v odsotnosti specifičnih gostiteljskih rastlin. . Podobno lahko gostitelji teh bakterij, stročnice, kot sta soja in detelja, dobro rastejo brez svojih simbiontov. Tako je simbioza stročnic in gomoljnih bakterij prej fakultativna kot obvezna zveza. Običajno je koristen za oba organizma, ni pa nujen za njun razvoj. Vsak partner tega združenja lahko živi svoje življenje in je za to dobro opremljen. Zato lahko pričakujemo, da se bo v procesu okužbe in vzpostavljanja simbioze razvoj nodulnih bakterij hitro spreminjal, tj. da bo prišlo do prilagoditve, ki jim bo omogočila prehod iz kompleksnega habitata v tleh v dinamično okolje na korenini. površino, nato pa v zelo posebno okolje znotraj celic lastnika. Tudi gostiteljska rastlina se mora hitro odzvati na prisotnost simbiotskih bakterij na površini svojih korenin, odzivi gostitelja pa se morajo izrazito razlikovati od njihovih reakcij na druge talne mikroorganizme. V gostiteljski rastlini se morajo zgoditi pomembne notranje spremembe, zaradi katerih lahko sprejme svojega bakterijskega partnerja in preide s porabe vezanega dušika iz eksogenih virov na asimilacijo simbiotično nastalega NH 3 . Jasno je, da je proces okužbe in razvoj simbiotskega odnosa sestavljen iz cele vrste vzajemnih prilagoditev. Ta proces je v mnogih pogledih podoben okužbi dovzetnega gostitelja s patogenim organizmom, hkrati pa sta precej različna.

Okužba soje z Rhizobium japonicum se očitno začne z reakcijo bakterije na prisotnost signalov in hranil, ki jih izločajo korenine gostitelja. Celice Rhizobiuma se zelo hitro pritrdijo na površino korenin in jih je mogoče odkriti v nekaj sekundah ali minutah po inokulaciji korenin. Pritrditev bakterij je najpogosteje polarna. Naslednja faza, opažena v infekcijskem procesu, je zvijanje koreninskih dlak. Zvijanje in deformacijo slednjih izzovejo posebej nodulne bakterije. Zvijanje se začne nekaj ur po inokulaciji in postane opazno po približno 12 urah.Nodulne bakterije prodrejo v zvite koreninske dlačice na mestu največje ukrivljenosti in se vnesejo vanje v obliki cevaste strukture, imenovane infekcijska nit. Ti filamenti nosijo rizobialne celice, običajno v eni sami verigi, do dna koreninskega laska (do bazalne celice). Zdi se, da konica rastoče okužbe sledi poti jedra gostiteljske celice. Preden okužbna nit zapusti bazalno celico lasu, so bližnje kortikalne celice stimulirane, da se delijo in napolnijo s citoplazmo. Infekcijske niti prodrejo v celično steno, ki se nahaja med koreninsko lasno celico in sosednjimi kortikalnimi celicami, ter se razvejajo in zajamejo številne neprestano deleče se kortikalne celice. Nato se celice nodulnih bakterij sprostijo iz konic okužbenih niti v citoplazmo gostiteljskih celic. Ko so bakterije enkrat sproščene, se kapsulirajo s citoplazemskimi membranami gostiteljskih celic in tako nikoli ne pridejo v neposreden stik z gostiteljsko citoplazmo. Celice nodulnih bakterij in gostiteljske rastline se razmnožujejo in tvorijo strukture, imenovane noduli, ki so sestavljene iz približno enakih mas bakterij in rastlinskih tkiv v masnem razmerju. Gostitelj oskrbuje rizobije s produkti fotosinteze, bakterije pa pretvarjajo atmosferski N 2 v NH 3, s čimer oskrbujejo rastline z razpoložljivim dušikom.

To je neverjeten proces, izjemen po svoji specifičnosti, mehanizmih delovanja, razvoju in regulativni dovršenosti. Gledati in preučevati ga je pravo veselje.

Začeli smo sistematično in večplastno študijo okužbe s con Rhizobium japonicum. Moji kolegi pri tem delu so bili fiziologi Arvind Bhagwat, Margaret Pierce in T. V. Bhuvaneswari; citologi Gillian Turgeon, Mark Pence in Harry Calvert; biokemik Andrew Mort; in specialista za mutagenezo Yang Lo in Poko Yamamoto. Študije nodulnih bakterij so se začele s študijem mehanizmov prepoznavanja in specifičnosti gostitelja. Vsaj za večino stročnic, ki živijo v zmernem pasu, obstaja dobro opredeljena specifičnost za rizobije. Rhizobium meli-loti na primer tvori gomolje samo z lucerno in ne okuži detelje ali drugih stročnic. Sevi R. japonicum tvorijo nodule samo s sojo, ne pa tudi z lucerno, deteljo itd.

Molekularna osnova specifičnosti gostitelja in nodulnih bakterij

Specifičnost gostitelja in mehanizmi prepoznavanja so že vrsto let obsežno področje raziskav rastlinskih patologov, vključno s tistimi, ki preučujejo Rhizobium symbioses. Leta 1975 sta Albersheim in Anderson-Prouty predstavila teoretično predpostavko, da reakcija prepoznavanja v sistemih rastlina-patogen vključuje proteine, ki vežejo ogljikove hidrate (tj. lektine) gostitelja, ki reagirajo z ogljikovimi hidrati na površini celičnih sten mikroorganizmov. Skoraj istočasno sta Bolul in Schmidt zagotovila eksperimentalne dokaze za tesno povezavo med sposobnostjo različnih nodulnih bakterij, da okužijo sojo, in njihovo sposobnostjo, da vežejo označeni lektin v semenih te rastline. Poskuse Bolula in Schmidta smo preizkusili z največjo skrbnostjo in potrdili korelacijo med tvorbo nodulov in vezavo lektina z rizobijami. Vendar so bila v znanstveni literaturi opažena nekatera odstopanja od tega vzorca:

Brethauer in Paxton, Chen in Phillips, Lo in Strijdom niso poročali o korelaciji med vezavo lektina in tvorbo nodulov v soji;

Nekateri sevi R. japonicum so bili zelo aktivni pri nodulaciji, vendar niso vezali sojinega lektina;

V številnih sevih rizobij v kulturi je le majhno število celic (1–5 %) vezalo sojin lektin.

Na podlagi opazovanj smo ugotovili en pomemben vzorec, in sicer se sposobnost celic Rhizobium japonicum, da vežejo sojin lektin, dramatično spreminja s starostjo kulture. Ta ugotovitev nakazuje, da je pojav ali izginotje lektinskih receptorskih spojin na površini celic Rhizobium nekako reguliran. S proučevanjem možnosti sinteze lektinskega receptorja v odvisnosti od snovi, ki so prisotne v gostiteljskih koreninah, smo ugotovili, da vsi testirani sevi R. japonicum vežejo sojin lektin, ko rastejo v prisotnosti gostiteljskih korenin, medtem ko na laboratorijskih gojiščih veliko od sevi niso imeli celic, ki bi lahko vezale lektin. Vpliv korenin na tvorbo lektinskih receptorjev omogoča razlago nedoslednosti v rezultatih poskusov s tistimi sevi bakterij, ki so tvorile nodule, vendar niso vezale lektina, in tudi razumevanje pomanjkanja korelacije med temi procesi v poskusih drugih raziskovalcev. Še vedno pa ne vemo, katera od snovi v koreninah gostiteljske rastline je odgovorna za spremembe v sintezi receptorjev.

Slika 1. Vpliv starosti kulture Rhizobium japonicum seva 110 ARS na število celic, ki so sposobne vezati sojin lektin in na nastanek nodulov na primarnih koreninah nad oznako začetne lege koreninskega vrha (glej besedilo) v času inokulacije:

1 - število celic/ml; 2 - odstotek celic, ki vežejo lektin; 3 - število nodulov nad oznako glede na rastlino; 4 - odstotek rastlin z noduli nad oznako.

Prav tako je treba omeniti, da sta Dazzo in Hubbell vzpostavila podobno močno korelacijo med vezavo lektina in tvorbo nodulov v simbiotskem združenju detelje/Rhizobium trifolii.

Stabilnost korelacije z vezavo lektina v sistemu soja/R, japonicum nam omogoča, da razmislimo še o dveh vprašanjih:

Ali lahko trdimo, da pravi lektin, ki ga najdemo na površini sojinih korenin ob pravem času in na pravem mestu, resnično igra vlogo pri reakciji prepoznavanja?

Kakšna je narava sojinega lektinskega receptorja na celični površini Rhizobium japonicum?

Na prvo vprašanje trenutno ni dokončnega odgovora. Najboljši dokaz temu v prid so lahko podatki Staceyja in sod., ki so pokazali, da so označena protitelesa, specifična za lektin sojinega semena, vezala korenine soje, v nasprotju z označenimi nespecifičnimi serumskimi protitelesi. Nizka gostota vezave označenih protiteles lahko pojasni težko odkrivanje lektina v koreninah z drugimi, bolj neposrednimi biokemičnimi metodami.

Pri drugem vprašanju smo dobili popolnejše in natančnejše podatke. Glede na prepričljive citološke in biokemične poskuse se sojin lektin veže na material kapsule, ki obdaja celice Rhizobium japonicum. S feritinom označen sojin lektin se veže na bakterijski kapsularni material, ne pa tudi na zunanjo celično membrano. To razmerje je biokemično specifično, kot je razvidno iz metode inhibicije sladkornega haptena, in je brez vpliva artefaktov, ki izhajajo iz fiksacije, kot je bilo ugotovljeno s kriokirurgijo.

Kapsularni material smo izolirali iz dveh različnih sevov R. japonicum in ugotovili, da je sestavljen iz polisaharida, katerega struktura je prikazana na sliki 2. Morda je najpomembnejša značilnost kapsularnega polisaharida (CPS) prisotnost stranske verige galaktoze v vsako ponavljajočo se polimerno enoto. Vezava sojinega lektina na površino bakterijske celice je še posebej močno zavirana z dodatkom galaktoze ali N-acetilgalaktozamina, kar kaže, da galaktozi podobne strukture predstavljajo pomemben del lektinsko specifičnega vezavnega materiala. Galaktozilni ostanki CPS včasih vsebujejo metilno skupino na položaju 4. Po Hammarströmu in sod. se lektinski spanec ne veže na 4-O-metilgalaktozo. Zato je bilo posebno zanimivo odkritje sprememb v sestavi sladkorjev, vključenih v CPS, s starostjo bakterijskih kultur. V starih kulturah so bili galaktozilni ostanki v CPS pogosteje 4-O-metilirani.

riž. Slika 2. Struktura ponavljajoče se pentasaharidne enote, ki tvori kapsularni polisaharid/eksopolisaharid (CPS/EPS) v sevih R. japonicum 110/138:

Gl - glukoza; Ma - manoza; HUK - galakturonska kislina; Ga - galaktoza; Ac - acetat; Jaz - metnl.

Pretvorba nemetilirane galaktoze v metilirano poteka še posebej hitro v obdobju, ko bakterijske kulture prehajajo iz eksponentne v stacionarno rastno fazo. Hkrati se nenadoma zmanjša število inkapsuliranih celic in bakterij, ki so sposobne vezati lektinski spanec. Spremembe v sestavi CPS in inkapsulaciji so razlog za nenadno izgubo sposobnosti vezave lektina teh sevov. Kot bo prikazano kasneje, ko dosežejo stacionarno rastno fazo, tudi ti sevi nenadoma izgubijo svojo kužnost. Ni še ugotovljeno, ali obstajajo vzročne povezave med spremembami v kemiji CPS, vezavo lektina in infektivnostjo Rhizobium.

Upoštevati je treba, da sevi R. japonicum sintetizirajo tako kapsularni polisaharid (CPS), ki se veže na gostitelja, kot eksopolisaharid (EPS), ki se na gostitelja ne veže. Po Dudmanu nekateri sevi R. japonicum tvorijo EPS, katerega struktura je prikazana na sliki 3. Ta EPS, izoliran iz filtratov kulture, ne vsebuje galaktozi podobnih ostankov, ki bi lahko vezali sojin lektin. Če slednja deluje kot vrstno specifična determinanta v reakcijah prepoznavanja za vse bakterije, ki tvorijo nodule na soji, potem morajo tudi ti sevi R. japonicum, vsaj v majhnih količinah, tvoriti neke vrste CPS ali EPS. z lektinskim vezavnim mestom galaktoznega tipa. Po nekaterih predhodnih podatkih sta dva seva nodulnih bakterij, ki tvorita EPS tipa ramnoze, sposobna sintetizirati tudi majhne količine CPS/EPS, ki vsebuje galaktozo (Mort, neobjavljeni podatki).

Sposobnost celic R. japonicum, da vežejo lektinski spanec, je strogo odvisna od prisotnosti kapsularnega materiala na bakterijah. Vendar nastanek vozličkov ni odvisen od tega. Mutanti R. japonicum, ki v nobeni fazi rasti niso tvorili opaznih kapsul, tako na laboratorijskih hranilnih gojiščih kot pri gojenju z gostilnimi koreninami, so kljub temu precej zlahka tvorili vozliče na koreninah spanca. Pomemben dejavnik sposobnosti nodulacije je sposobnost sintetiziranja ustreznih količin polisaharida, ki vsebuje galaktozo. Obstaja linearna povezava med količino EPS, ki jo sintetizirajo različni mutanti rizobije, in njihovo relativno sposobnostjo tvorbe nodulov. S pojavom določene količine polisaharida, ki vsebuje galaktozo, ni več pomembno, ali je povezan z bakterijskimi celicami ali je v prostem stanju.

riž. Slika 3. Struktura ponavljajočega se monomera v tetrasaharidu, ki je del EPS Rhizobium japonicum seva 61A76; oznake so enake kot na sliki 2 (Rha - rafinoza).

Slika 1. Razmerje med sintezo EPS in tvorbo nodulov na koreninah soje z različnimi mutanti Rhizobium japonicum, ki ne proizvajajo normalnih kapsul

Zamisel, da so gostiteljski lektini in površinski polisaharidi celic Rhizobium edine determinante specifičnosti in prepoznavnosti v interakcijah simbiontov, se lahko šteje za preveč poenostavljeno. Če Dazzo in Stacey et al. menijo, da so gostiteljski lektini odgovorni za specifično pritrditev homolognih nodulnih bakterij na gostiteljsko površino, drugi raziskovalci poudarjajo indukcijo specifičnih gostiteljskih odzivov s tvorbo lektin-polisaharidnih vezi. Vendar se zdi bolj verjetno, da so te interakcije le del kompleksnega zaporedja izmenjav signalov in odzivov med obema simbiontoma. S tega vidika vsaka stopnja v taki zaporedni verigi na svoj način določa celotno biološko specifičnost simbioze. Nobenega koraka v procesu prepoznavanja ni mogoče izključiti samo zato, ker ni prvi ali najbolj selektiven, hkrati pa ni mogoče domnevati, da prvi ali najbolj selektiven korak v celoti določa specifičnost simbiotskega odnosa.

Zgodnji procesi pri okužbah, ki jih povzroča RHIZOBIUM

Presenetljivo malo je znanega o začetku ali zgodnjem razvoju okužb, ki jih povzročajo nodulne bakterije v njihovih simbiontih, čeprav nekatera nedavna dela zagotavljajo dragocene informacije o teh vprašanjih. Kot smo že omenili, je prva zunanja manifestacija infekcijskega procesa pritrditev bakterij na površino gostiteljskih korenin. Celice Rhizobiuma se nagibajo k polarni pritrditvi. Po Dazzu je taka pritrditev določena z gostiteljskim lektinom in je specifična za sistem detelja/R, trifolii. Stacy idr. so poročali o podobnih podatkih za R. japonicum na koreninah soje. Vendar smo ugotovili, da se tako R. trifolii kot R. japonicum lahko polarno pritrdita na korenine soje v precej primerljivem številu in gostoti (Tergen in Bauer, neobjavljeno). Narava pritrditve obeh vrst se v pogojih naših poskusov praktično ni razlikovala. Ne glede na to, ali je navezanost specifična ali nespecifična in včasih vmesna, je treba priznati, da do zdaj ni znanega niti o celičnih in molekularnih komponentah, ki povzročajo navezanost, niti o mehanizmih delovanja teh komponent.

Druga manifestacija infekcijskega procesa je indukcija zvijanja koreninskih laskov. Zdi se, da je funkcija tega pojava stiskanje celic Rhizobium v ​​prostoru med obema površinama celičnih sten ukrivljenega koreninskega laska. Doslej še nihče ni uspel identificirati snovi, ki povzročajo zvijanje ali razvejanje koreninskih dlačic, prav tako niso raziskani mehanizmi, po katerih pride do zvijanja.

Tretja manifestacija nalezljivega procesa je nastanek nalezljive niti. Callahamova nedavna raziskava je zagotovila zelo pomembne informacije o tem procesu. Predlagal je tri možne modele za vstop Rhizobiuma v gostiteljsko celico:

Lokalna invaginacija celične stene koreninskega lasu;

Lokalno uničenje celične stene lasu s pomočjo induciranih encimov samega gostitelja in sintezo infekcijske niti;

Lokalno uničenje celične stene koreninske dlake z encimi Rhizobium in sinteza niti okužbe.

Rezultati Callahamovih študij so prepričljivo pokazali, da proces okužbe detelje z bakterijo R. trifolii vključuje lokalno uničenje celičnih sten koreninskih laskov v bližini ujetih bakterij, povezano z lokalnim odlaganjem nove plasti neidentificiranega materiala, iz katerega se nastane infekcijska nit. Ta usedlina je zelo podobna tvorbi ovoja (ohišja) okoli okuženih hif patogenih gliv. Callahamove citološke študije so omogočile izključitev hipoteze o invaginaciji celične stene koreninskega dlaka, vendar niso rešile vprašanja, čigavi encimi povzročajo lokalno uničenje celičnih sten - encimi gostitelja ali bakterije? Nekatera sporočila podpirajo obe možnosti, vendar ne nudijo dokončnega odgovora.

Tudi številna vprašanja v zvezi z nadaljnjimi stopnjami infekcijskega procesa še niso rešena. Na primer, kako lahko okužbna nit vstopi v gostiteljsko celico proti njenemu turgorskemu tlaku? Zakaj (in kako) konica rastoče niti okužbe sledi gibanju jedra v lasni celici? Kako okužbna nit prodre v sosednje kortikalne celice? Kako se stimulira delitev kortikalnih celic med razvojem infekcijskega procesa, ki ga povzroči prodor niti? Kako se lahko nodulne bakterije izognejo ali zatrejo normalno obrambo gostiteljske rastline?

Na žalost resne metodološke težave preprečujejo podrobno študijo zgodnjih faz infekcijskega procesa. Težave nastanejo zaradi dejstva, da v procesu inokulacije običajno sodeluje približno 100 tisoč bakterijskih celic in približno 10 tisoč koreninskih laskov, vendar se infekcijski proces ne začne v več kot 100 primerih in le približno 10 primerov okužbe se konča s tvorbo vozličev. Zato je težko upoštevati mehanizme ali neznane korake infekcijskega procesa pri skupno 10 uspešnih ali 100 okužbah koreninskih dlak v primerjavi z 10.000 ali več neuspelimi ali neobčutljivimi interakcijami gostitelj-Rhizobium.

riž. 4. Diagram, ki prikazuje faze infekcijskega procesa, ki ga povzročajo nodulne bakterije. Nodulne bakterije, zaprte v prostoru med dvema površinama ukrivljenega koreninskega laska, uničijo steno gostiteljske celice (a), povzročijo sintezo nove plasti materiala iz citoplazme stene gostiteljske celice (b) in prodrejo delno skozi uničeno celično steno lasne korenine v nit okužbe, ki nastane iz na novo odložene plasti (c).

Lokalizacija okuženih celic na koreninah gostiteljske rastline

Da bi olajšali metodologijo za preučevanje biokemičnih mehanizmov prepoznavanja in procesov okužbe, smo se pred kratkim odločili ugotoviti, katere koreninske celice gostitelja so dovzetne za okužbo. Sadike rastlin so bile vzgojene v plastičnih vrečkah, kar je omogočalo vizualno opazovanje razvijajočih se korenin. Na plastiki smo ob vnosu inokuluma označili položaj koreninskih vršičkov (KK) in cono nastajanja koreninskih dlak. Teden dni po inokulaciji smo določili položaj vsakega nodula ob upoštevanju narejenih oznak. Ob upoštevanju gibanja epidermalnih celic med rastjo korenin je možno izračunati položaj in razvojno fazo tistih koreninskih celic, ki so bile v času inokulacije z nodulnimi bakterijami dovzetne za okužbo. Iz grafov (sl. 5.5) je jasno razvidno, da so noduli najpogosteje nastajali v tistih delih korenin, ki so bili neposredno pod cono koreninskih dlak in nad cono hitrega raztezanja. V območju razvijajočih se koreninskih dlačic je nastalo razmeroma malo nodulov, v predelih korenin, pokritih z zrelimi dlačicami, ob inokulaciji pa jih sploh ni bilo. Sposobnost tvorbe nodulov je torej omejena z določenimi fazami razvoja korenin in kratkotrajnostjo obstoja ciljnih celic, dovzetnih za bakterije. Poskusi s poznejšo inokulacijo spanja so pokazali, da celotna koreninska površina nad konico opazno izgubi občutljivost po 4-6 urah.Pri drugih vrstah stročnic je tudi sposobnost tvorjenja vozličkov kratkotrajna in omejena na določene faze razvoja.

Ti podatki so nedvomno teoretičnega in praktičnega pomena. Nanolitrske kapljice inokulacijske suspenzije, ki vsebuje le nekaj celic nodulnih bakterij, lahko na primer nanesemo neposredno na mesto največje občutljivosti korenine in razvoj Rhizobiuma se bo zgodil točno na mestu inokulacije. Ta metoda nam je omogočila, da smo z elektronskim mikroskopom proučevali najzgodnejše procese, ki se zgodijo še pred nastankom infekcijske nitke, zvijanjem koreninskega dlaka ali kakršnih koli drugih indikatorjev začetka okužbe, vidnih pod svetlobnim mikroskopom. Izvajanje takšnih študij je možno le z zadostnim zaupanjem, da so koreninske dlake, vzete za pripravo ultratankih rezov, primerne za ta namen in bodo okužene z nodulnimi bakterijami.

riž. 5. Pogostost nodulacije v različnih conah korenin soje, inokuliranih s sevom 110 R. japonicum. Rastline smo gojili v plastičnih vrečkah, na površino katerih smo naredili oznake, ki prikazujejo položaj koreninske kapice (RT) in mesto najmanjšega razvoja koreninskih dlak (SERH). Korenine približno 120 rastlin smo pregledali en teden po inokulaciji in določili relativno (%) razdaljo od vsakega nodula, ki je nastal na primarni korenini, do RT. Za lažjo določitev relativnega položaja neokuženih celic koriuma med inokulacijo smo izračunali gibanje epidermalnih celic glede na RT.

Snovi, ki vplivajo na intenzivnost začetnih infekcijskih procesov

Enako zanimiv vidik preučevanja stopnje razvoja občutljivosti stročnic na nodulne bakterije je, da je zdaj mogoče preučevati dejavnike, ki vplivajo na stopnjo uspešnega začetka okužbe. Število nodulov, ki se razvijejo nad koreninsko konico (RT) nad oznako na plastiki, je odličen kvantitativni parameter za razvoj okužbe. Na primer, Bhagwat (osebna komunikacija) je pred kratkim ugotovil, da pride do nodulacije nekaterih rizobij na koreninah kravjega fižola neposredno pod oznako, če so bile bakterije gojene na mediju skupaj s koreninami gostitelja pred inokulacijo. Ti rezultati kažejo, da se Rhizobium lahko prilagodi ali na nek način odzove na snovi, ki se sproščajo iz gostiteljske korenine, preden pridobijo sposobnost okužbe.

Pri soji lahko opazimo nasprotno. Tvorba nodulov na koreninah soje nad oznako RT je malo odvisna od predhodne kultivacije R. japonicum v koreninskih izločkih gostitelja. Vendar se nodulacija največkrat pojavi pod območjem razvoja koreninskih dlačic, čeprav so tudi citološke študije pokazale, da se okužba, ki povzroči nastanek nodulov, pojavi prek kratkih koreninskih dlak, ki se šele začenjajo razvijati. Razlike med lokalizacijo pričakovanega in dejanskega območja maksimalne tvorbe nodulov so nas pripeljale do zaključka, da obstaja določeno obdobje zamika med časom prve interakcije koreninskih celic z bakterijami in časom začetka uspešnega procesa okužbe. v njih. Očitno je mogoče to obdobje zamika skrajšati s predhodno obdelavo korenin s celičnim polisaharidom nodulnih bakterij. V zvezi s tem je učinkovita tudi N-acetilgalaktoza, možni polisaharidni hapten spalnega lektina. Takšne poskuse je težko natančno reproducirati, vendar smo našli načine za nadzor večine spreminjajočih se spremenljivk.

Relativna razdalja med noduli in znamenjem na koreninski konici (RT)

Slika 6. Vpliv izločkov kravjega fižola na razvoj nodulnih bakterij:

1 bakterije na koreninskih izločkih; 2 - bakterije na sintetičnem hranilnem mediju.

riž. Sl. 7. Vpliv brezceličnega filtrata Rhizobium tri-folii na nastanek nodulov v coni zrelih koreninskih dlak pri detelji. Korenine detelje smo pred vnosom inokuluma predhodno obdelali s 100 μl vode (4) ali filtratom kulture 6, 14 in 24 ur (1, 2, 3 na grafu). Število nodul. ki so nastale v območju korenin z zrelimi koreninskimi dlačicami v času inokulacije, so določali dnevno en teden.

Podoben pojav so opazili pri koreninah detelje. Če kulturo R. trifolii speremo, resuspendiramo v destilirani vodi eno uro in nato filtriramo, brezcelični filtrat izrazito skrajša čas, potreben za nodulacijo v območju zrelih koreninskih dlačic, ko se korenine tretirajo s tem filtratom pred inokulacijo. . Zanimivo je, da enako tretiranje korenin detelje ni opazno vplivalo na čas nastanka nodulov v coni brez koreninskih dlak.

Filtrat deluje na nodulacijo le v območju zrelih koreninskih dlačic, kar očitno vpliva na drugo vrsto okužbe, ki je značilna za deteljo, ni pa je opažena pri soji, strnem grahu ali lucerni.

Aktivne spojine, ki so prisotne v filtratih suspenzije bakterije R. trifolii ali v izločkih korenin kravjega fižola, še niso bile identificirane. Kljub temu odkritje njihovega delovanja potrjuje stališče, da je medsebojno prepoznavanje nodulnih bakterij in njihovih gostiteljev kompleks reakcij, ki se pojavljajo med simbionti tipa signal-odziv.

Infektivna sposobnost celic RHIZOBIUM

Za okužbo z rizobijami so dovzetne le nekatere celice korenin metuljnic, dovzetnost pa je odvisna od časa in faze razvoja rastline. Kaj lahko rečemo o nodulnih bakterijah? Ali je kužnost Rhizobiuma odvisna od časa, faze razvoja ali okolja? Učinek izločkov korenin kravjega fižola na nodulacijo rizobij nakazuje, da morajo vsaj nekatere vrste bakterij prestati določene spremembe, preden lahko povzročijo okužbo. Seveda se lahko tudi v isti kulturi celice Rhizobiuma med seboj razlikujejo v marsičem. Na primer, lahko imajo različne sposobnosti inkapsulacije, gibljivost, faze celičnega cikla in število polarnih telesc. Možno je, da je nalezljivost odvisna od ene ali več teh posebnih lastnosti. Iz zgornjih podatkov sledi, da v nasprotju s sintezo EPS sama inkapsulacija ni videti povezana z infektivnostjo. Glede na novejše študije infekcijska sposobnost nodulnih bakterij ni odvisna od njihove mobilnosti.

Z delom v našem laboratoriju smo ugotovili, da je kužnost R. japonicum v veliki meri odvisna od starosti kulture. Kulture R. japonicum sevov 110 in 138, ko so dosegle stacionarno rastno fazo, so hitro izgubile sposobnost povzročanja nodulacij nad oznako RT. Očitno je, da so v tej fazi bakterije manj pripravljene ali sposobne povzročiti infekcijski proces med inokulacijo kot celice v eksponentni fazi. Osnova te spremembe proti koncu eksponentne faze ni znana. Študija vpliva odmerka inokuluma na proces nodulacije je pokazala, da lahko kulture seva 110 R. japonicum, ki so v zgodnji ali pozni fazi stacionarne rasti, inducirajo nodulacijo tako hitro in intenzivno kot kulture v fazi eksponentne rasti. , vendar je za inokulacijo rastlin potrebno več inokuluma starih kultur.

Zato so razlike v infektivnosti med kulturami bakterij v eksponentni ali stacionarni fazi rasti bolj kvantitativne kot kvalitativne. Zdi se, da kulture v stacionarni fazi vsebujejo sorazmerno manj celic, ki lahko hitro inducirajo okužbo.

Drug vidik oblikovanja simbiotskih združenj si zasluži pozornost. Grafi pogostosti nodulacije kažejo oslabitev intenzivnosti tega procesa v spodnjih delih korenin, ki so bili ob inokulaciji 5-10 ur mlajši od območij z največjo aktivnostjo nodulacije. Očitno imajo sojine rastline hitro delujoč regulacijski mehanizem, ki služi preprečevanju razvoja prevelikega števila vozličkov na koreninah. Druga možna razlaga je, da je zmanjšanje števila vozličkov v spodnjih delih korenin lahko povezano z zmanjšanjem števila bakterij v teh delih. Če pa smo iste korenine ponovno inokulirali 10-12 ur po prvem nanosu bakterij, ni prišlo do sprememb v nastajanju nodulov, torej ni bilo potrebe po povečanju števila bakterij. Če pa je bil primarni inokulum apliciran samo na zgornji del korenine brez koreninskih dlačic in v cono mladih, razvijajočih se dlačic, kjer je bilo podaljšanje korenine v celoti ali večinoma končano, potem je sekundarno inokulacijo povzročilo nastanek novih nodule. Ta poskus kaže, da hitrodelujoči regulacijski mehanizem v spanju rastline vključuje določeno vrsto interakcije med Rhizobiumom in tistimi gostiteljskimi celicami, ki so lokalizirane v območju hitrega raztezanja korenine v bližini njene konice.

Prisotnost hitrodelujočega regulacijskega mehanizma v rastlinah soje in morda kravjega fižola ter lucerne ustvarja dodatno plast kompleksnosti in organizacije v dinamičnem vplivu razvojnih faz in okolja na zgodnji razvoj in uspeh okužb z nodulnimi bakterijami.

Uporabljena literatura: Nalezljive bolezni rastlin: fiziološke in biokemijske osnove / Per. iz angleščine. L. L. Velikanova, L. M. Levkina,
V. P. Prohorov, I. I. Sidorova; Ed. in s predgovorom.
Yu.T.Dyakova. - M.: VO Agropromizdat, 1985. - 367 str.

Prenesi povzetek: Nimate dostopa do prenosa datotek z našega strežnika.

V velikih količinah ($72\%$), vendar je nevtralen (popolnoma nedostopen rastlinam za asimilacijo).

$10\%$ rastlin iz družine stročnic vstopi v simbiozo z bakterijami (bakterije so bile najdene tudi na koreninah družine jelševcev iz družine Brez).

Nodulne bakterije spadajo v rod Rhizodium. Njihova glavna lastnost je sposobnost fiksiranja molekularnega dušika iz atmosferskega zraka in sintetiziranja organskih spojin, ki vsebujejo dušik. Te bakterije, ki vstopajo v simbiozo s stročnicami, lahko tvorijo vozliče na svojih koreninah. Pretvorijo plinasti dušik v spojine, ki so takoj na voljo za vnos rastlin, cvetoče rastline pa zagotavljajo hranila za bakterije. Prav tako ima ta vrsta bakterij pomembno vlogo v procesu obogatitve tal z dušikom.

Velikost nodulnih bakterij je $0,3 - 3$ mikronov. Imajo zaobljeno obliko, sluzasto konsistenco, prozorno. Za razliko od drugih bakterij ne tvorijo spor, se lahko premikajo in za normalno delovanje potrebujejo kisik.

Bakterije, ki prodrejo v koreninski las rastline, spodbujajo intenzivno delitev koreninskih celic, zaradi česar nastane vozliček. Bakterije same se razvijejo v teh vozličih in sodelujejo v procesu asimilacije dušika. Tam se preoblikujejo in pridobijo razvejano obliko - bakteroid, ki absorbira molekularni dušik, nitrate, aminokisline in amonijeve soli. Mono- in disaharidi, organske kisline in alkoholi služijo kot vir ogljika za nodulne bakterije.

Rastline tudi oskrbujejo bakterije z vitalnimi organskimi hranili. Ta oblika simbioze pozitivno vpliva na oba organizma – simbionta:

  • bakterije dobijo možnost, da gredo skozi svoj razvojni cikel normalno;
  • rastlina se normalno razvija in v zadostnih količinah prejema najbolj potrebno mineralno hranilo - dušik.

Opomba 1

Takšen vir prehrane rastlin se imenuje biološki, stročnice pa se imenujejo kultura, ki obogati tla (po K. A. Timiryazevu).

Za razliko od večine rastlin stročnice ne le ne osiromašijo tal, temveč jih tudi obogatijo z dušikovimi spojinami. Obogatitev nastane pri gojenju stročnic (volčji bob, grah, soja, detelja, lucerna, grašica, sladka detelja) in nadaljnji razgradnji njihovih korenin in listov.

Ko korenine stročnic odmrejo, nodulne bakterije ne odmrejo, ampak vodijo saprofitni način življenja.

Nodulne bakterije so sposobne absorbirati do 300 $ kg dušika iz atmosferskega zraka na $ 1 $ hektara stročnic, medtem ko več kot 50 $ kg dušikovih spojin še ostane v tleh.

Opomba 2

Različne oblike bakterij imajo specifično nagnjenost k razvoju nekaterih predstavnikov stročnic na koreninah: Rhizodium Leguminosarum - v grahu, krmnem fižolu, grašici; Rh. Meliloti - v sladki detelji, lucerni; Rh. Japonicum - v soji; Rh. Trifolium - v detelji.

Pomen in možnosti simbioze bakterij in metuljnic

Tovrstna simbioza je zelo pomembna v naravi in ​​predvsem pri gojenju rastlin, saj jim zagotavlja večjo hranilno vrednost in produktivnost ter hkrati obnavljanje tal in povečanje njihove rodovitnosti.

Stročnice so osnova sodobnega alternativnega kmetovanja – brez uporabe gnojil ali z vnosom v majhnih odmerkih.

K.A. Timirjazev je ugotovil, da so stročnice prodrle povsod, kamor sežejo zdravi koncepti kmetijstva. Toda v zgodovini je komaj veliko odkritij, ki bi bila tako koristna za človeštvo, kot je uporaba detelje in nasploh stročnic v kolobarjenju, da bi lahko tako dramatično povečali kmetijsko produktivnost.

Stročnice se danes zelo gojijo po vsem svetu. Njihov pomen je velik in bo ostal in se celo povečeval, saj so vir ekološkega in ekonomskega (praktično brezplačnega) dušika.

V $XXI$ stoletju z visoko razvitimi tehnologijami za proizvodnjo mineralnih gnojil (najpomembnejša med njimi so dušikova) prihaja do dve tretjini dušika, ki se uporablja v svetovnem kmetijstvu, iz bioloških virov, predvsem zaradi stročnic in njihovi simbionti - nodulne bakterije, ki vežejo dušik . V gomoljih se zgodi najpomembnejša biokemična reakcija za simbiozo: pretvorba molekularnega dušika v zraku v nitrate in nato v amonij.

Z uporabo rezultatov sodobnih študij odnosa simbionskih bakterij z rastlinami so mikrobiologi predlagali pomembno nalogo za prihodnost - določiti načine za ustvarjanje skupnosti za izboljšanje mineralne prehrane rastlin z biološkim dušikom. Ta simbioza je sistem z različnimi interakcijami, ki so večinoma povezane s povečanjem genetske plastičnosti organizmov, kar lahko privede celo do nastanka bistveno novih oblik življenja. Simbioza daje naravi takšno priložnost in to je bistveni del nove sodobne doktrine simbioze.

Opomba 3

Da bi povečali število gomoljnih bakterij in s tem tudi pridelek metuljnic, dodamo zemlji ob setvi posebno baktericidno sredstvo nitragin (semena umetno okužimo z nodičnimi bakterijami.



Oddelki