Анаэробная среда. Виды аэробных бактерий. Отличие анаэробов от аэробов

Бактерии присутствуют в нашем мире повсеместно. Они везде и всюду, и количество их разновидностей просто поражает.

В зависимости от необходимости наличия кислорода в питательной среде для осуществления жизнедеятельности микроорганизмы классифицируют на следующие виды.

• Облигатные аэробные бактерии, которые собираются в верхней части питательной среды, в составе флоры был максимальный объем кислорода.
• Облигатные анаэробные бактерии, которые находятся в нижней части среды, максимально далеко от кислорода.
• Факультативные бактерии в основном обитают в верхней части, но могут быть распределены по всей среде, так как не зависят от кислорода.
• Микроаэрофилы предпочитают небольшую концентрацию кислорода, хотя и собираются в верхней части среды.
• Аэротолерантные анаэробы равномерно распределяются в питательной среде, нечувствительны к наличию или отсутствию кислорода.

Понятие анаэробных бактерий и их классификации

Термин «анаэробы» появился в 1861 году, благодаря работам Луи Пастера.

Анаэробные бактерии – это микроорганизмы, которые развиваются вне зависимости от присутствия в питательной среде кислорода. Они получают энергию путем субстратного фосфорилирования . Различают факультативные и облигатные аэробы, а также другие виды.

Наиболее значимые анаэробы - бактероиды

Наиболее значимыми аэробами являются бактероиды. Примерно пятьдесят процентов всех гнойно-воспалительных процессов , возбудителями которых могут быть анаэробные бактерии, приходится на бактероиды.

Бактероиды – это род граммотрицательных облигатных анаэробных бактерий. Это палочки с биполярной окрашиваемостью, размер которых не превышает 0,5-1,5 на 15 мкм. Вырабатывают токсины и ферменты, которые могут вызывать вирулентность. Различные бактероиды обладают разной устойчивостью к антибиотикам: встречаются как устойчивые, так и чувствительные к антибиотикам.

Вырабатывание энергии в тканях человека

Некоторые ткани живых организмов обладают повышенной устойчивостью к пониженному содержанию кислорода. В стандартных условиях синтез аденозинтрифосфата идет аэробным путем, но при повышенных физических нагрузках и при воспалительных реакциях на первый план выходит анаэробный механизм.

Аденозинтрифосфат (АТФ) – это кислота, играющая важную роль при вырабатывании организмом энергии. Существует несколько вариантов синтеза этого вещества: один аэробный и целых три анаэробных.

К анаэробным механизмам синтеза АТФ относятся:

• перефосфорилирование между креатинфосфатом и АДФ;
• реакция трансфосфорилирования двух молекул АДФ;
• анаэробное расщепление глюкозы крови или запаса гликогена.

Культивирование анаэробных организмов

Существуют специальные методы для выращивания анаэробов. Они заключаются в замене воздуха на газовые смеси в герметизированных термостатах.

Другим способом будет выращивание микроорганизмов в питательной среде, в которую добавляют редуцирующие вещества.

Питательные среды для анаэробных организмов

Существуют общие питательные среды и дифференциально-диагностические питательные среды . К общим относят среду Вильсона-Блера и среду Китта-Тароцци. К дифференциально-диагностическим – среды Гисса, среду Ресселя, среду Эндо, среду Плоскирева и висмут-сульфитный агар.

Базой для среды Вильсона-Блера является агар-агар с добавлением глюкозы, сульфита натрия и двухлористого железа. Черные колонии анаэробов образуются в основном в глубине агарового столбика.

Среда Ресселя (Рассела) используется в изучении биохимических свойств таких бактерий, как шигеллы и сальмонеллы. Она также содержит агар-агар и глюкозу.

Среда Плоскирева подавляет рост многих микроорганизмов, поэтому ее используют в дифференциально-диагностических целях. В такой среде хорошо развиваются возбудители брюшного тифа, дизентерии и другие патогенные бактерии.

Основное назначение висмут-сульфитного агара – выделение сальмонелл в чистом виде. Данная среда основывается на способности сальмонелл производить сероводород. Данная среда схожа со средой Вильсона-Блера по применяемой методике.

Анаэробные инфекции

Большинство анаэробных бактерий, живущих в организме человека или животных, могут вызывать различные инфекции. Как правило, заражение происходит в период ослабления иммунитета или нарушения общей микрофлоры организма. Также существует вероятность попадания возбудителей инфекций из внешней среды, особенно поздней осенью и зимой.

Инфекции, вызванные анаэробными бактериями, как правило, связаны с флорой слизистых оболочек человека, то есть с основными местами обитания анаэробов. Как правило, у таких инфекций сразу несколько возбудителей (до 10).

Точное число заболеваний, вызванных анаэробами, практически невозможно определить в связи с затрудненным сбором материалов для анализа, транспортировкой образцов и культивированием самих бактерий. Чаще всего этот тип бактерий обнаруживают при хронических заболеваниях.

Анаэробным инфекциям подвержены люди любого возраста. При этом у детей уровень инфекционных заболеваний выше.

Анаэробные бактерии могут вызывать различные внутричерепные заболевания (менингит, абсцессы и другие). Распространение, как правило, происходит с током крови. При хронических заболеваниях анаэробы способны вызывать патологии в области головы и шеи: отит, лимфадениты, абсцессы . Несут опасность эти бактерии и желудочно-кишечному тракту, и легким. При различных заболеваниях мочеполовой женской системы также существует риск развития анаэробных инфекций. Различные заболевания суставов и кожи могут быть следствием развития анаэробных бактерий.

Причины появления анаэробных инфекций и их признаки

К возникновению инфекций приводят все процессы, во время которых на ткани попадают активные анаэробные бактерии. Также развитие инфекций могут вызвать нарушенное кровоснабжение и некроз тканей (различные травмы, опухоли, отеки, болезни сосудов). Инфекции ротовой полости, укусы животных, легочные заболевания, воспалительные заболевания тазовых органов и многие другие заболевания также могут быть вызваны именно анаэробами.

В разных организмах инфекция развивается по-разному. На это влияет и вид возбудителя, и состояние здоровья человека. Из-за трудностей, связанных с диагностированием анаэробных инфекций, заключение часто основывается на предположениях. Отличаются некоторыми особенностями инфекции, вызванные неклостридиальными анаэробами .

Первыми признаками заражения тканей аэробами являются нагноения, тромбофлебиты, газообразование. Некоторые опухоли и новообразования (кишечные, маточные и другие) также сопровождаются развитием анаэробных микроорганизмов. При анаэробных инфекциях может появляться неприятный запах, однако, его отсутствие не исключает анаэробов в качестве возбудителя инфекции.

Особенности получения и транспортировки образцов

Самым первым исследованием в определении инфекций, вызванных анаэробами, является визуальный осмотр. Различные кожные поражения являются частым осложнением. Также свидетельством жизнедеятельности бактерий будет наличие газа в зараженных тканях.

Для лабораторных исследований и установления точного диагноза, прежде всего, надо грамотно получить образец материи из пораженного участка. Для этого используют специальную технику, благодаря которой нормальная флора не попадает в образцы. Наилучший метод – это аспирация прямой иглой. Получение лабораторного материала методом мазков не рекомендуется, но возможно.

К числу проб, непригодных для проведения дальнейшего анализа, относятся:

• мокроты, полученные путем самовыделения;
• пробы, которые получены при бронхоскопии;
• мазки из влагалищных сводов;
• моча при свободном мочеиспускании;
• фекалии.

Для исследования могут быть использованы:

• кровь;
• плевральная жидкость;
• транстрахеальные аспираты;
• гной, полученный из полости абсцесса;
• спинно-мозговая жидкость;
• пунктаты легких.

Транспортировать образцы необходимо максимально быстро в специальном контейнере или пластмассовой сумке с анаэробными условиями, так как даже кратковременное взаимодействие с кислородом может вызвать гибель бактерий. Жидкие образцы перевозят в пробирке или в шприцах. Тампоны с образцами транспортируют в пробирках с углекислым газом или заранее подготовленными средами.

В случае диагностирования анаэробной инфекции для адекватного лечения необходимо следовать следующим принципам:

• токсины, вырабатываемые анаэробами, надо нейтрализовать;
• среду обитания бактерий следует изменить;
• распространение анаэробов нужно локализовать.

Для соблюдения этих принципов в лечении используют антибиотики , которые воздействуют как на анаэробов, так и на аэробные организмы, так как часто флора при анаэробных инфекциях носит смешанный характер. При этом, назначения лекарственные препараты, врач должен оценить качественный и количественный состав микрофлоры. К средствам, которые активны против анаэробных возбудителей относят: пенициллины, цефалоспорины, хлопамфеникол, фторхиноло, метранидазол, карбапенемы и другие. Некоторые препараты имеют ограниченное действие.

Для контроля среды обитания бактерий в большинстве случаев используют хирургическое вмешательство, которые выражается в обработке пораженных тканей, дренировании абсцессов, обеспечении нормальной циркуляции крови. Игнорировать хирургические методы не стоит из-за риска развития опасных для жизни осложнений.

Иногда используют вспомогательные методы лечения , а также из-за трудностей, связанных с точным определением возбудителя инфекции, применяют эмпирическое лечение.

При развитии анаэробных инфекций в ротовой полости также рекомендуется добавить в рацион как можно больше свежих фруктов и овощей. Наиболее полезны при этом яблоки и апельсины. Ограничению подвергают мясную пищу и фастфуд.

Анаэробные организмы

Аэробные и анаэробные бактерии предварительно идентифицируются в жидкой питательной среде по градиенту концентрации O 2:
1. Облигатные аэробные (нуждающиеся в кислороде) бактерии в основном собираются в верхней части пробирки, чтобы поглощать максимальное количество кислорода. (Исключение: микобактерии - рост пленкой на поверхности из-за восколипидной мембраны.)
2. Облигатные анаэробные бактерии собираются в нижней части, чтобы избежать кислорода (либо не дают роста).
3. Факультативные бактерии собираются в основном в верхнем ( является наиболее выгодным, чем гликолиз), однако они могут быть найдены на всем протяжении среды, так как от O 2 не зависят.
4. Микроаэрофилы собираются в верхней части пробирки, но их оптимум - малая концентрация кислорода.
5. Аэротолерантные анаэробы не реагируют на концентрации кислорода и равномерно распределяются по пробирке.

Анаэробы - организмы, получающие энергию при отсутствии доступа кислорода путем субстратного фосфорилирования , конечные продукты неполного окисления субстрата при этом могут быть окислены с получением большего количества энергии в виде АТФ в присутствии конечного акцептора протонов организмами, осуществляющими окислительное фосфорилирование .

Анаэробы - обширная группа организмов, как микро-, так и макроуровня:

• анаэробные микроорганизмы - обширная группа прокариотов и некоторые простейшие.
• макроорганизмы - грибы , водоросли , растения и некоторые животные (класс фораминиферы , большинство гельминтов (класс сосальщики , ленточные черви , круглые черви (например, аскарида)).

Помимо этого анаэробное окисление глюкозы играет важную роль в работе поперечно-полосатой мускулатуры животных и человека (особенно в состоянии тканевой гипоксии).

Классификация анаэробов

Согласно устоявшейся в микробиологии классификации, различают:

• Факультативные анаэробы
• Капнеистические анаэробы и микроаэрофилы
• Аэротолерантные анаэробы
• Умеренно-строгие анаэробы
• Облигатные анаэробы

Если организм способен переключаться с одного метаболического пути на другой (например, с анаэробного дыхания на аэробное и обратно), то его условно относят к факультативным анаэробам .

До 1991 года в микробиологии выделяли класс капнеистических анаэробов , требовавших пониженной концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислоты (Бруцеллы бычьего типа - B. abortus )

Умеренно-строгий анаэробный организм выживает в среде с молекулярным O 2 , однако не размножается. Микроаэрофилы способны выживать и размножаться в среде с низким парциальным давлением O 2 .

Если организм не способен «переключиться» с анаэробного типа дыхания на аэробный, но не гибнет в присутствии молекулярного кислорода , то он относится к группе аэротолерантных анаэробов . Например, молочнокислые и многие маслянокислые бактерии

Облигатные анаэробы в присутствии молекулярного кислорода O 2 гибнут - например, представители рода бактерий и архей : Bacteroides , Fusobacterium , Butyrivibrio , Methanobacterium ). Такие анаэробы постоянно живут в лишенной кислорода среде. К облигатным анаэробам относятся некоторые бактерии, дрожжи, жгутиковые и инфузории.

Токсичность кислорода и его форм для анаэробных организмов

Среда с содержанием кислорода является агрессивной по отношению к органическим формам жизни. Это связано с образованием активных форм кислорода в процессе жизнедеятельности или под действием различных форм ионизирующего излучения, значительно более токсичных, чем молекулярный кислород O 2 . Фактор, определяющий жизнеспособность организма в среде кислорода - наличие у него функциональной антиоксидантной системы, способной к элиминации:супероксид-аниона(O 2 −),перекиси водорода (H 2 O 2), синглетного кислорода (O .), а также молекулярного кислорода (O 2) из внутренней среды организма. Наиболее часто подобная защита обеспечивается одним или несколькими ферментами:

• супероксиддисмутаза , элиминирующая супероксид-анион(O 2 −) без энергетической выгоды для организма
• каталаза , элиминирующая перекись водорода (H 2 O 2) без энергетической выгоды для организма
• цитохром - фермент, отвечающий за перенос электронов от NAD H к O 2 . Этот процесс обеспечивает существенную энергетическую выгоду организму.

Аэробные организмы содержат чаще всего три цитохрома, факультативные анаэробы - один или два, облигатные анаэробы не содержат цитохромов.

Анаэробные микроорганизмы могут активно воздействовать на среду, создавая подходящий окислительно-восстановительный потенциал среды (напр. Cl.perfringens). Некоторые засеянные культуры анаэробных микроорганизмов, прежде чем начать размножаться, снижают pH 2 0 с величины до , ограждая себя восстановительным барьером, другие - аэротолерантные - в процессе жизнедеятельности продуцируют перекись водорода, повышая pH 2 0 .

При этом характерным только для анаэробов является гликолиз , который в зависимости от конечных продуктов реакции разделяют на несколько типов брожению :

• молочнокислое брожение - род Lactobacillus ,Streptococcus , Bifidobacterium , а также некоторые ткани многоклеточных животных и человека.
• спиртовое брожение - сахаромицеты , кандида (организмы царства грибов)
• муравьинокислое - семейство энтеробактерий
• маслянокислое - некоторые виды клостридий
• пропионовокислое - пропионобактерии(например, Propionibacterium acnes )
• брожение с выделением молекулярного водорода - некоторые виды клостридий , ферментация Stickland
• метановое брожение - например, Methanobacterium

В результате расщепления глюкозы расходуется 2 молекулы, а синтезируется 4 молекулы АТФ . Таким образом общий выход АТФ составляет 2 молекулы АТФ и 2 молекулы НАД·Н 2 . Полученный в ходе реакции пируват утилизируется клеткой по-разному в зависимости от того, какому типу брожения она следует.

Антагонизм брожения и гниения

В процессе эволюции сформировался и закрепился биологический антагонизм бродильной и гнилостной микрофлоры:

Расщепление микроорганизмами углеводов сопровождается значительным снижением среды, в то время как расщепление белков и аминокислот - повышением (защелачиванием). Приспособление каждого из организмов к определенной реакции среды играет важнейшую роль в природе и жизни человека, например, благодаря бродильным процессам предотвращается загнивание силоса, заквашенных овощей, молочных продуктов.

Культивирование анаэробных организмов

Выделение чистой культуры анаэробов схематично

Культивирование анаэробных организмов в основном является задачей микробиологии.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его специализированной газовой смесью (или инертными газами) в герметизированных термостатах - анаэростатах .

Другим способом выращивания анаэробов(чаще всего микроорганизмов) на питательных средах - добавление содержащих редуцирующие вещества (глюкозу , муравьинокислый натрий и др.), уменьшающие окислительно-восстановительный потенциал.

Общие питательные среды для анаэробных организмов

Для общей среды Вильсона - Блера базой является агар-агар с добавлением глюкозы , сульфита натрия и двуххлористого железа. Клостридии образуют на этой среде колонии чёрного цвета за счет восстановления сульфита до сульфид - аниона , который соединяясь с катионами железа (II) дает соль чёрного цвета. Как правило, черные на этой среде образования колонии , появляются в глубине агарового столбика.

Среда Китта - Тароцци состоит из мясопептонного бульона, 0,5% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 - 30 минут для удаления воздуха из среды. После посева питательную среду сразу заливают слоем парафина или вазелинового масла для изоляции от доступа кислорода.

Общие методы культивирования для анаэробных организмов

GasPak - система химическим путем обеспечивает постоянство газовой смеси, приемлемой для роста большинства анаэробных микроорганизмов. В герметичном контейнере, в результате реакции воды с таблетками боргидрида натрия и бикарбоната натрия образуется водород и диоксид углерода . Водород затем реагирует с кислородом газовой смеси на палладиевом катализаторе с образованием воды, уже вторично вступающей в реакцию гидролиза боргидрида.

Данный метод был предложен Брюером и Олгаером в 1965 году. Разработчики представили одноразовый пакет, генерирующий водород, который был позднее усовершенствован ими до саше, генерирующих двуокись углерода и содержащих внутренний катализатор.

Метод Цейсслера применяется для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого производят посев на среду Китт-Тароцци, прогревают 20 мин при 80 °C (для уничтожения вегетативной формы), заливают среду вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч в термостате. Затем производят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования интересующие колонии изучаются - их пересеивают на среду Китт-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Фортнера

Метод Фортнера - посевы производят на чашку Петри с утолщенным слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. Одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую - анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробной микрофлоры, а затем (после поглощения кислорода) - рост аэробной резко прекращается и начинается рост анаэробной.

Метод Вейнберга используется для получения чистых культур облигатных анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, переносят в сахарный бульон. Затем одноразовой пастеровской пипеткой материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным мясо-пептонным агаром, погружая пипетку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают, что позволяет фиксировать бактериальный материал в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют в термостате, а затем изучают выросшие колонии. При обнаружении интересующей колонии на её месте делают распил, материал быстро отбирают и засеивают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Перетца

Метод Перетца - в расплавленный и охлаждённый сахарный агар-агар вносят культуру бактерий и заливают под стекло, помещённое на пробковых палочках(или фрагментах спичек) в чашку Петри . Метод наименее надежен из всех, но достаточно прост в применении.

Дифференциально - диагностические питательные среды

• Среды Гисса («пестрый ряд»)
• Среда Ресселя (Рассела)
• Среда Плоскирева или бактоагар «Ж»
• Висмут-сульфитный агар

Среды Гисса : К 1 % пептонной воде добавляют 0,5 % раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза и др.) и кислотно-щелочной индикатор Андреде, разливают по пробиркам, в которые помещают поплавок для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении углеводородов.

Среда Ресселя (Рассела) применяется для изучения биохимических свойств энтеробактерий(шигелл, сальмонелл). Содержит питательный агар-агар , лактозу, глюкозу и индикатор (бромтимоловый синий). Цвет среды травянисто-зелёный. Обычно готовят в пробирках по 5 мл со скошенной поверхностью. Посев осуществляют уколом в глубину столбика и штрихом по скошенной поверхности.

Среда Плоскирева (бактоагар Ж) - дифференциально-диагностическая и селективная среда, поскольку подавляет рост многих микроорганизмов, и способствует росту патогенных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов, дизентерии). Лактозоотрицательные бактерии образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозоположительные - красные. В составе среды - агар, лактоза, бриллиантовый зелёный , соли желчных кислот, минеральные соли, индикатор (нейтральный красный).

Висмут-сульфитный агар предназначен для выделения сальмонелл в чистом виде из инфицированного материала. Содержит триптический гидролизат, глюкозу, факторы роста сальмонелл, бриллиантовый зелёный и агар. Дифференциальные свойства среды основаны на способности сальмонелл продуцировать сероводород , на их устойчивости к присутствию сульфида, бриллиантового зелёного и лимоннокислого висмута. Маркируются колонии в чёрный цвет сернистого висмута (методика схожа со средой Вильсона - Блера ).

Метаболизм анаэробных организмов

Метаболизм анаэробных организмов имеет несколько различных подгрупп.